β-雙酮類抗生素復(fù)合脅迫對斑馬魚發(fā)育影響的分子毒理學(xué)機制.pdf

1、β-雙酮類抗生素（β-Diketone antibiotics，DKAs）是分子中含有β-雙酮功能基團的抗生素家族統(tǒng)稱，主要包括四環(huán)素與喹諾酮兩大類。盡管DKAs半衰期較短而易于降解，但緣于其廣譜抗菌效應(yīng)，實際生產(chǎn)與應(yīng)用十分廣泛。高頻使用與持續(xù)排放很容易導(dǎo)致DKAs在自然環(huán)境中出現(xiàn)“假持久”濃度效應(yīng)，進而產(chǎn)生代謝毒性與積累毒性，從而對生態(tài)系統(tǒng)造成一定威脅。
　　DKAs隨代謝廢物及醫(yī)療、工業(yè)污染物等進入自然環(huán)境中的成分十分復(fù)雜，不

2、同家族成員彼此之間可能具有交互毒理效應(yīng)。因此針對 DKAs的環(huán)境毒理學(xué)研究，以單劑作為研究對象所獲得的結(jié)論并不充分。本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，選取了三種喹諾酮類與三種四環(huán)素類等六種最常見的具有典型代表性的DKAs，以斑馬魚作為實驗?zāi)Ｐ?，設(shè)置0 mg/L（空白對照）、6.25 mg/L以及12.5 mg/L濃度梯度，通過體外染毒方式對斑馬魚進行長期DKAs脅迫并建立起染毒品系。采用新一代高通量illumina RNA-Seq深度測序技術(shù)，

3、對不同濃度脅迫下的斑馬魚染毒品系進行了轉(zhuǎn)錄組與microRNAs的深度測序以及生物信息學(xué)分析。
　　生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在p≤0.05及差異倍數(shù)至少為1倍的篩選條件下，共有215條成熟體miRNAs出現(xiàn)組間顯著性差異表達。將這215條miRNAs利用TargetScan在線軟件與轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果數(shù)據(jù)進行交叉比對，總計獲得獲得4076個有差異表達的靶基因，其中51個靶基因在各組之間呈現(xiàn)共同差異性表達。這51個共同差

4、異的靶基因中，有45個能注釋到KOG數(shù)據(jù)庫中進行功能分類，有34個能夠注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中進行信號通路分析。結(jié)合生物信息分析結(jié)果，針對215條陽性差異的miRNAs分子，參考諸多文獻挑選出高豐度表達同時有顯著性組間差異的20條 miRNAs，并在 miRBase中通過與人類miRNAs進行序列同源性比對來評估其保守性，共有17個miRNAs成熟體序列與人類的比對一致。
　　在生物信息分析的基礎(chǔ)上，利用qRT-PCR技術(shù)對20條候

5、選miRNAs進行了表達量驗證實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總共有12個miRNAs的表達變化趨勢與測序結(jié)果表現(xiàn)一致，占60％以上。之后，從中篩選了4個代表性的miRNAs分子（dre-miR-10c，dre-miR-92a，dre-miR-184與dre-miR-96），在TargetScan數(shù)據(jù)庫中尋找了一批結(jié)合自由能低、結(jié)合概率高的下游靶基因并構(gòu)建出分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以進一步明確其功能系統(tǒng)。
　　本研究在 dre-miR-92a與 dre-mi

6、R-10c高表達的靶器官中進行了組織切片原位雜交，并結(jié)合病理切片染色觀察，研究DKAs脅迫下miRNAs分子表達量變化與靶器官的病理學(xué)損傷。發(fā)現(xiàn) dre-miR-92a在心臟中的表達與 dre-miR-10c在肝臟中的表達模式相近，都是隨著DKAs暴露濃度的升高而表達量呈下降趨勢，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。同時，斑馬魚心臟與肝臟在DKAs脅迫下均出現(xiàn)了一系列的病理學(xué)變化。
　　通過研究dre-miR-96與dre-miR-184兩

7、個與神經(jīng)系統(tǒng)正常行使功能高度相關(guān)的miRNAs在腦部表達量的變化和腦組織病理切片，重點研究了 DKAs脅迫下對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響以及長期脅迫下的成魚神經(jīng)組織損害。結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的表達量均隨著DKAs脅迫而降低，并且腦組織也出現(xiàn)了一系列病變。
　　為了進一步支持上述研究結(jié)論，我們首先采用qPCR技術(shù)，對這兩個miRNAs分子篩選出的下游調(diào)控靶基因經(jīng)由 DKAs脅迫后的表達模式變化進行了驗證。qPCR驗證結(jié)果顯示部分下游靶基因的表

8、達量變化與miRNAs的變化呈負調(diào)控關(guān)系。之后，通過顯微注射技術(shù)，對這兩個miRNAs進行了過表達與抑表達，并對注射后胚胎進行了表型觀察以及對靶基因表達模式變化的qPCR驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個 miRNAs分子無論是過表達還是抑制表達均會導(dǎo)致一系列的生理畸形，同時靶基因表達量也全部發(fā)生了變化。隨后，鑒于本研究前期工作中發(fā)現(xiàn)DKAs脅迫下斑馬魚耳囊發(fā)育呈現(xiàn)畸形，故借助于 Noldus行為分析儀對斑馬魚幼體進行了聲刺激反射的行為學(xué)檢測，結(jié)果