空腸彎曲菌血紅素氧合酶ChuZ的結(jié)構(gòu)解析與功能研究.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，C. jejuni)是一種重要的食源性感染病原菌。全球范圍內(nèi)，空腸彎曲菌感染是急性胃腸炎最常見(jiàn)的病因之一,其嚴(yán)重的并發(fā)癥為Guillain-Barré和Miller-Fischer綜合癥。隨著日益嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，C. jejuni感染的控制和治療受到嚴(yán)峻的考驗(yàn)，迫切需要尋找新的途徑來(lái)控制這類致病菌的感染。鐵對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)是至關(guān)重要的，盡管地球上有著非常豐富的鐵元素，但是對(duì)于

2、致病菌來(lái)說(shuō)鐵的生物利用度卻相當(dāng)?shù)汀?duì)C. jejuni來(lái)說(shuō)，來(lái)自宿主紅細(xì)胞裂解的血紅蛋白血紅素(heme)是其鐵的主要來(lái)源。而血紅素氧合酶ChuZ在降解血紅素并獲取鐵的機(jī)制中起到非常重要的作用。
　　本研究擬解析ChuZ的晶體結(jié)構(gòu)，從分子水平闡明C. jejuni利用鐵元素的機(jī)制，從而為以ChuZ為靶點(diǎn)，通過(guò)阻斷C. jejuni對(duì)鐵元素的攝取，開(kāi)發(fā)抗C. jejuni感染的的新型藥物提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1

3、．chuZ基因克隆及重組ChuZ蛋白的制備。
　　以C. jejuni（NCTC11168）全基因組為模板，PCR擴(kuò)增chuZ基因并構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET22b上，采用E. coli BL21工程菌表達(dá)ChuZ蛋白。依次采用親和層析、分子篩層析和離子交換層析方法純化得到高質(zhì)量的ChuZ蛋白。
　　2．ChuZ結(jié)晶條件搜索。
　　采用Hampton Research公司的72孔板(HR3-086)和晶體初篩試劑盒Ind

4、ex、crystal screen HR110、SaltRx和PEG/ion等，通過(guò)Mircobatch法進(jìn)行初步的結(jié)晶條件篩選，在得到初步結(jié)晶條件的基礎(chǔ)上，對(duì)結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化獲得最終的結(jié)晶條件。
　　3．晶體數(shù)據(jù)收集處理和結(jié)構(gòu)解析。
　　X-射線晶體衍射方法收集到ChuZ-hemin的衍射數(shù)據(jù)，采用分子置換法以已有結(jié)構(gòu)（3GAS）為模型獲得相位并解析得到ChuZ-hemin復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并對(duì)最終模型進(jìn)行分析。
　

5、　4．酶活相關(guān)關(guān)鍵殘基功能分析。
　　在結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，制備參與結(jié)合底物血紅素的相關(guān)殘基突變體，對(duì)參與結(jié)合底物血紅素的相關(guān)殘基進(jìn)行突變，檢測(cè)突變體的酶學(xué)活性并與野生型ChuZ活性相比較，驗(yàn)證和評(píng)價(jià)ChuZ酶活的關(guān)鍵殘基。
　　5．表面獨(dú)特的血紅素結(jié)合位點(diǎn)的分析。
　　分別用紫外分光光度法和ITC法測(cè)量ChuZ蛋白及其突變體與血紅素的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合比例。
　　6．突變體晶體結(jié)構(gòu)分析。
　　制備參與結(jié)合底物血

6、紅素的相關(guān)殘基突變體蛋白，結(jié)合hemin后采用制備ChuZ晶體同樣方法、收集衍射數(shù)據(jù)并解析突變體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　1．成功構(gòu)建了表達(dá)ChuZ蛋白的重組質(zhì)粒pET22b-chuZ，并實(shí)現(xiàn)了其以可溶形式表達(dá)。經(jīng)多種層析方法的聯(lián)合應(yīng)用后，純化得到了高純度的ChuZ蛋白，蛋白純度達(dá)到95％以上。
　　2.以出現(xiàn)針狀晶體條件優(yōu)化，最終晶體生長(zhǎng)條件為：蛋白濃度168mg/ml，microbatch板生長(zhǎng)，池液條件：

7、0.1M MES23％PEG40050mM pH6.5 iminazole50mM ammonium tartrate,蛋白與池液1:1混合放置3天后即出現(xiàn)紅色棍狀晶體，七天后晶體大小為0.1×0.1×0.7 mm3.
　　3．運(yùn)用X-射線晶體衍射法收集了一套2.4?分辨率的ChuZ-hemin數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)處理結(jié)果：空間群C2221，晶胞參數(shù)a=106.474，b=106.698，c=52.464?，α=β=γ=90°。運(yùn)用PHAS

8、ER程序以HugZ(PDB ID3GAS)為模型，采用分子置換法解析了ChuZ的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)采用split-barrel折疊方式，明顯不同于經(jīng)典的全α螺旋的單體血紅素氧合酶的結(jié)構(gòu)。明確了參與底物結(jié)合的關(guān)鍵殘基如R166、H9和H14。
　　4．成功構(gòu)建了R166A、H245Q/R166A、H245Q/H9A/H14A、R166A/H9A/H14A、H9A/H14A突變體，通過(guò)酶活實(shí)驗(yàn)明確了R166A/H9A/H14A完全喪失了

9、酶的活性。
　　5．紫外吸光度值測(cè)定結(jié)果表明：H9A/H14A的ChuZ突變體結(jié)合一個(gè)hemin，野生型ChuZ結(jié)合1.5個(gè)hemin。ITC結(jié)果表明H9A/H14A突變體和wild-type ChuZ的結(jié)合常數(shù)與其它細(xì)菌的HO基本一致，結(jié)合比例與紫外結(jié)果和晶體結(jié)構(gòu)中一致。
　　6．獲得了H9A/H14A突變體的晶體，并收集得到一套3?的數(shù)據(jù)，電子密度圖顯示，其表面血紅素結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有血紅素的殘余密度，提示該突變體喪失了結(jié)合血

10、紅素的能力。
　　結(jié)論：
　　ChuZ的三維結(jié)構(gòu)采取獨(dú)特的split-barrel折疊方式，與大多數(shù)獲得結(jié)構(gòu)解析的全α螺旋的單體血紅素氧合酶的結(jié)構(gòu)明顯不同，屬于一個(gè)以HugZ為代表的新的血紅素氧合酶家族。ChuZ在溶液和晶體中以同源二聚體存在。在ChuZ的精細(xì)結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的血紅素結(jié)合位點(diǎn)，它與普遍存在于血紅素蛋白中的“經(jīng)典位點(diǎn)”不同，位于分子表面通過(guò)水分子介導(dǎo)的四個(gè)組氨酸結(jié)合血紅素，這樣的結(jié)合方式在其他血紅素氧合酶中尚未