豬血中氯化血紅素和凝血酶分離提取的研究.pdf

1、研究從豬血中分離提取氯化血紅素和凝血酶的工藝，建立了其定性和定量的分析方法。 豬血的抗凝處理、紅細(xì)胞和血漿的分離。收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的新鮮豬血，用0.38％的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比1：9混合抗凝，抗凝血在轉(zhuǎn)速為4000r/min(離心力為1790g)下，離心10min，分別收集紅細(xì)胞和血漿，用于提取氯化血紅素和凝血酶。 研究了氯化血紅素的提取條件。優(yōu)化后的條件為：(1)加入紅細(xì)胞體積1/5的去離子水，實(shí)驗(yàn)條件下，超聲波功

2、率200W，破碎10min，得到血紅蛋白溶解液。(2)選用鞣酸法從超聲波破碎紅細(xì)胞得到的血紅蛋白溶解液中提取氯化血紅素。向血紅蛋白溶液中加入紅細(xì)胞體積5倍的丙酮，用1mol/L稀HCl調(diào)其pH值為2.2，抽濾，收集提取液。向提取液中加入5％鞣酸，靜置12h后產(chǎn)生沉淀。抽濾，收集沉淀，并對(duì)其用去離子水、50％的乙酸、95％乙醇、乙醚依次各洗滌二次，所得產(chǎn)品放入干燥器避光干燥，最后得到紅紫色固體。通過(guò)分析對(duì)比氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的紅外光譜

3、圖和紫外/可見(jiàn)光譜圖，確定所得產(chǎn)品為氯化血紅素。 利用該工藝每1000ml豬血可以獲得氯化血紅素3.2克左右，純度達(dá)到91％左右，收率為78％左右。用超聲波法代替機(jī)械攪拌法對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行破碎，時(shí)間縮短了2/3，使氯化血紅素的收率提高了15％左右。 建立和優(yōu)化了凝血酶的分離純化的條件：(1)血漿的預(yù)處理。血漿-20℃下冷凍一天，4℃解凍，可除去纖維蛋白原，所得凝血酶的總活性提高了3.7％。(2)凝血酶原的分離采用檸檬酸鋇吸附

4、法。1mol/L的氯化鋇最適加入量為血漿體積的8％。(3)凝血酶原激活采用單獨(dú)使用CaCl2法。通過(guò)研究Ca2+終濃度、激活溫度、時(shí)間對(duì)凝血酶原激活的影響，獲得優(yōu)化后的激活條件為：Ca2+的終濃度為0.1mol/L，在25℃下激活2h。(4)采用DEAE-纖維素DE-52對(duì)凝血酶粗品進(jìn)行純化，pH7.2、0.05mol/LTris-HCl緩沖液上樣，用含0～1.0mol/LNaCl的pH7.2、0.05mol/LTris-HCl緩沖液進(jìn)

5、行線性梯度洗脫，收集凝血酶活性峰，凝血酶的比活達(dá)到604.4U/mg，回收率為74.3％，純化倍數(shù)為15.7。再經(jīng)SephadexG-75進(jìn)一步純化，用pH7.2、0.05mol/LTris-HCl緩沖液上樣、洗脫，得到凝血酶電泳單點(diǎn)純，比活為998.6U/mg，回收率為55.7％，純化倍數(shù)為25.9。 通過(guò)對(duì)血漿進(jìn)行冷凍處理，使所得凝血酶的總活力提高了3.7％，同時(shí)也得到了凝血酶的底物—纖維蛋白原。單獨(dú)使用CaCl2激活凝血酶