羅非魚血液中超氧化物歧化酶和血紅素的分離純化及其特性研究.pdf

1、中國擁有豐富的羅非魚資源,產(chǎn)業(yè)化的羅非魚加工業(yè)正在不斷發(fā)展壯大。血液是羅非魚加工中的主要副產(chǎn)物之一,含有豐富的活性物質(zhì),卻一直作為廢棄物排放,若能進(jìn)行科學(xué)有效的利用,則具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景,不僅能有效地減少環(huán)境污染,還能顯著地增加企業(yè)的附加值。本文以羅非魚血液為原料,采用現(xiàn)代生物技術(shù),從中分離純化超氧化物歧化酶(SOD)和血紅素,并對相關(guān)工藝進(jìn)行條件優(yōu)化研究,建立了一套高效、易于規(guī)模放大的從羅非魚血中提純SOD和血紅素的新工藝。另外,

2、還對羅非魚血SOD和血紅素的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行研究,可為今后合理開發(fā)利用羅非魚血液資源提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)羅非魚血SOD分離純化工藝研究
　　采用超聲波輔助細(xì)胞破碎,乙醇、氯仿沉淀和熱變性處理得到 SOD粗酶液,利用多功能蛋白快速純化液相色譜系統(tǒng)控制,將SOD粗酶液進(jìn)行離子交換和凝膠過濾兩次純化,經(jīng)超濾濃縮管濃縮得 SOD終產(chǎn)品。通過對 SOD提純工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究,得到SOD提純最優(yōu)條件:①超聲波破膜處

3、理:超聲功率400W,超聲波作用時(shí)間20min,細(xì)胞稀釋倍數(shù)3倍;②乙醇、氯仿沉淀:乙醇添加量30％、氯仿添加量30%、攪拌時(shí)間20min左右;③熱變性:加熱溫度60℃,熱處理時(shí)間15~30min;④離子交換色譜:流動(dòng)相為pH8.020mmol/L的Tris-HCl緩沖液,分步洗脫條件為10%B液、20min→30%B液、15min→100%B液、15min,最佳上樣量4mL,最大流速150cm/h;⑤凝膠過濾層析:洗脫緩沖液為20mm

4、ol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.15mol/L NaCl)。
　　羅非魚血SOD的純化結(jié)果:比活力為8136U/mg,回收率為54.5%,純化倍數(shù)為1892,經(jīng)PAGE鑒定為一條帶,達(dá)到了電泳純。
　　(2)羅非魚血SOD酶學(xué)性質(zhì)研究
　　通過敏感度試驗(yàn)、光譜學(xué)分析、亞基分子量測定、pH和熱穩(wěn)定性試驗(yàn)以及動(dòng)力學(xué)模型分析,對SOD酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果表明:羅非魚血SOD對KCN和H2O2敏感,紫外

5、特征吸收波長為260nm,熒光光譜掃描的最大激發(fā)波長λex為289nm,最大發(fā)射波長λem為327nm,SDS-PAGE測得其亞基分子量約為16KDa,它在pH5-9、70℃以下穩(wěn)定,在鄰苯三酚氧化體系中的米氏常數(shù)Km為0.4mmol/L,最大反應(yīng)速率Vmax為400μmol/min。
　　(3)血紅素的酶解法提純工藝研究
　　采用酶解法制備血紅素粗產(chǎn)物,再通過熱處理、酸沉淀、離心和真空冷凍干燥等方法得血紅素終產(chǎn)品。通過對酶

6、解等工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究,得到血紅素提純最優(yōu)條件:①酶種類的選擇:經(jīng)復(fù)合酶水解的血紅素濃度最高,為65.9 mg/100mL,水解效果最佳,最適反應(yīng)溫度為40℃,最適pH為7.0。②單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳酶解條件:底物濃度6%、酶添加量8000U/g、酶解時(shí)間2h。③熱處理:將酶解液進(jìn)行沸水浴處理15min,然后冷卻至室溫,用2M氫氧化鈉溶液將酶解液調(diào)成pH9-10的弱堿環(huán)境,充分?jǐn)嚢韬箪o置20min,離心(3000×g,10m

7、in),去除沉淀。④酸沉淀:用冰醋酸調(diào)節(jié)酶解液pH5-6,充分?jǐn)嚢韬箪o置20min,離心(3000×g,10min),收集沉淀。
　　血紅素產(chǎn)品的提純結(jié)果:回收率為80.9%,純度為28.2%。
　　(4)血紅素相關(guān)性質(zhì)研究
　　通過超濾技術(shù)定性分析、紫外-可見光譜掃描圖譜分析、高效液相色譜定性分析、Fe2+/Fe3+組成分析以及外觀分析等,對血紅素產(chǎn)品相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行研究:①超濾定性分析發(fā)現(xiàn),所得產(chǎn)品中約25%的血紅素以

8、與多肽結(jié)合的形式存在,相對分子量在5-10KDa范圍內(nèi),而75%的血紅素則可能以單體的形式存在。②樣品與血紅素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外-可見光譜掃描和HPLC定性分析發(fā)現(xiàn),樣品特征波長為385nm,樣品中的特征成分為血紅素,且含量與28.2%一致。③Fe2+和Fe3+含量分析可知,樣品中二價(jià)鐵殘留率為37%,因此,在樣品制備過程中應(yīng)該加強(qiáng)二價(jià)鐵的保護(hù)。④樣品外觀性狀研究發(fā)現(xiàn),血紅素標(biāo)準(zhǔn)品在顯微鏡下觀察為紫色針狀晶體,樣品呈紫色針狀晶體或藍(lán)紫色粉末