血紅素加氧酶-1(HO-1)小干擾RNA抑制胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系GC9811-P體外侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究.pdf

1、[背景]
　　胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)。近年來，胃癌的發(fā)病率雖有所下降，但其死亡率仍居高不下。出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志著病程已進(jìn)入晚期，晚期胃癌患者約60％是由于發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移所致的頑固性癌性腹水、惡液質(zhì)等而死亡。并且在胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)中腹膜轉(zhuǎn)移占50%左右，成為死亡的主要原因之一。胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是一個(gè)多分子參與的復(fù)雜過程：首先，胃癌組織侵犯胃壁漿膜層，進(jìn)入腹腔，進(jìn)而脫落的癌細(xì)胞將種植于腹膜組織，形成腹膜

2、轉(zhuǎn)移，這就是被廣泛認(rèn)可的“種子—土壤”學(xué)說。當(dāng)胃癌發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移后，臨床治療效果十分不理想，因此，在參與腹膜轉(zhuǎn)移的諸多分子中，找到一個(gè)靶向分子，進(jìn)一步行靶向治療將是至關(guān)重要的。
　　前期工作中，我們成功建立了胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系GC9811-P，并通過噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)，篩選出了與胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞GC9811-P表面受體特異性結(jié)合的多肽PⅢ,進(jìn)一步通過篩選差異性表達(dá)的基因，結(jié)合親和層析技術(shù)，成功獲得了多肽PⅢ的受體分子——血紅素加

3、氧酶-1（Hemeoxygenase-1，HO-1），而且初步推測(cè)為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移特異性的靶分子。HO-1是一種催化血紅素氧化生成Fe++、CO、膽綠素的限速酶，膽綠素在膽綠素還原酶作用下，進(jìn)一步還原成膽紅素。血紅素加氧酶有三種形式，HO-1是一種誘導(dǎo)型酶，其刺激因子包括血紅素、氧化應(yīng)激及其他各種因素；HO-2是其組成型表達(dá)形式；HO-3是近年來才被發(fā)現(xiàn)的第三種形式，研究證實(shí)它與HO-2有相似作用。自1986年首次發(fā)現(xiàn)以來，大量研究證實(shí)H

4、O-1參與各種炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激過程，比如它有抗炎、抗凋亡及細(xì)胞保護(hù)作用。近年來，研究表明HO-1在各種惡性腫瘤中表達(dá)增高，并且參與腫瘤的抗凋亡過程，它也是腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移的一種調(diào)節(jié)因子。本課題將對(duì)HO-1在胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系GC9811-P中的表達(dá)情況作一檢測(cè)，同時(shí)，將構(gòu)建HO-1小干擾RNA的真核表達(dá)載體，進(jìn)一步探討其對(duì)GC9811-P細(xì)胞系的體外侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響。
　　[目的]
　　1、明確HO-1是否在胃癌腹膜

5、高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系GC9811-P中高表達(dá)；
　　2、探討下調(diào)GC9811-P中HO-1的表達(dá)是否會(huì)影響其體外侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　[方法]
　　1、利用Western-blot和RT-PCR的方法在蛋白和mRNA水平檢測(cè)HO-1在GC9811-P中的表達(dá)情況；
　　2、利用基因重組的方法構(gòu)建含有HO-1特異性小干擾RNA的真核表達(dá)載體；
　　3、經(jīng)脂質(zhì)體lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染GC9811-P

6、細(xì)胞系，通過Western-blot及RT-PCR檢測(cè)HO-1在蛋白及mRNA水平的表達(dá)變化；
　　4、通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察GC9811-P細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　[結(jié)果]
　　1、HO-1在胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞GC9811-P及其親本細(xì)胞GC9811中的表達(dá)情況Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示：HO-1在GC9811-P中的表達(dá)較GC9811明顯增高；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：HO-

7、1mRNA在GC9811-P中的表達(dá)較GC9811明顯增高。
　　2、成功構(gòu)建了HO-1-siRNA真核表達(dá)載體pEGFP-C1/HO-1-siRNA。
　　3、獲得成功轉(zhuǎn)染了HO-1-siRNA的GC9811-P細(xì)胞，mRNA及蛋白水平顯示HO-1在GC9811-P細(xì)胞中明顯下降，而轉(zhuǎn)染了空載體的細(xì)胞中HO-1表達(dá)無明顯變化。
　　4、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了HO-1-siRNA組GC9811-P細(xì)胞的遷移不明顯，

8、而轉(zhuǎn)染了空載體的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組細(xì)胞大量遷移至劃痕區(qū)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了HO-1-siRNA組GC9811-P細(xì)胞的穿膜數(shù)為（54.2±2.68），而轉(zhuǎn)染了空載體組細(xì)胞的穿膜數(shù)為（83.2±5.71），未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組細(xì)胞穿膜數(shù)為（84.3±4.29），LSD-t檢驗(yàn)分析各組間差異，HO-1-siRNA組細(xì)胞穿膜數(shù)小于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組（P<0.05），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間細(xì)胞穿膜數(shù)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)