MUC1模擬表位疫苗篩選和治療小鼠膀胱癌效應.pdf

1、目的：從噬菌體隨機12肽庫中篩選新的MUC1的模擬表位，觀察其免疫學特性，以及誘導機體產(chǎn)生特異性免疫應答和對小鼠膀胱癌的治療作用。構建MUC1模擬表位原核表達載體，獲得特異、純化的模擬表位融合蛋白。本研究為研制針對MUC1為靶點的腫瘤疫苗奠定基礎，為膀胱癌治療提供新方法。 方法：1.選用抗MUC1多肽表位的單克隆抗體BC2為篩選配基，利用噬菌體展示技術，從噬菌體隨機12肽庫中，通過3輪生物淘洗、測定噬菌體滴度、擴增噬菌斑、挑選特

2、異性陽性噬菌體克隆，通過ELISA實驗鑒定陽性噬菌體克隆與單克隆抗體BC2結合活性；抽提陽性噬菌體克隆的插入肽ssDNA模板，測定其DNA序列，按遺傳密碼表推導出插入肽的氨基酸序列，同MUC1核心肽表位序列APDTR進行比較，從中選出與原表位序列不同的模擬表位。利用表位預測專用數(shù)據(jù)庫SYFPEITHIdatabase進行氨基酸序列的表位預測，根據(jù)抗原肽的基序特征計算其積分，判斷其與MHCⅠ類分子結合能力，合成相應的模擬表位肽，通過競爭E

3、LISA實驗判斷模擬表位肽能否特異性抑制單克隆抗體BC2與MUC1抗原結合，進一步鑒定篩選出的MUC1模擬表位活性。2.利用陽離子脂質體介導轉染方法，將人MUC1全長cDNA轉入T739小鼠膀胱癌細胞BST739中，經(jīng)G418篩選和克隆化培養(yǎng)，基因組PCR、RT-PCR、免疫組化、流式細胞儀從不同水平檢測MUC1的表達，建立穩(wěn)定表達人MUC1T739小鼠膀胱癌細胞株，觀察轉入人MUC1腫瘤細胞體內外生長特性和體內致瘤性。3.無菌取T73

4、9小鼠股骨和脛骨，PBS沖出骨髓細胞，紅細胞裂解液裂解紅細胞，按2×106/ml的細胞密度加入含有樹突狀細胞(DC)專用培養(yǎng)基塑料培養(yǎng)皿，同時加入細胞因子rmGM-CSF，rmIL-41000U/ml，37℃，5％CO2體外培養(yǎng)，第6天加入LPS(1μg/ml)刺激DC成熟，第7天收集細胞，顯微鏡下觀察成熟DC形態(tài)，流式細胞儀檢測成熟DC標記33D1單抗的表達以判斷DC純度。4.體外用合成的模擬表位肽刺激成熟DC，PBS洗滌三次，然后分

5、別用PBS，未刺激的DC，MUC1模擬表位肽刺激的DC，通過小鼠尾靜脈注射，免疫T739小鼠，每只注射2×105細胞，每周免疫一次，共三次。免疫結束后，分離小鼠血清和脾細胞，ELISA檢測小鼠血清產(chǎn)生的模擬表位抗原特異性抗體，ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點，Enzyme-LinkedImmunoSPOT)檢測小鼠脾臟淋巴細胞產(chǎn)生的活化的模擬表位特異性T細胞，以免疫后的小鼠活化T細胞為效應細胞，以穩(wěn)定表達人MUC1T739小鼠膀胱癌細胞為靶

6、細胞，進一步用非放射性乳酸脫氫酶法檢測不同效：靶比例時活化的模擬表位特異性T細胞體外細胞毒效應。5.取對數(shù)生長期BST739-PC、BST739-MUC1細胞，分別皮下接種T739小鼠，2×106/只，建立皮下荷瘤鼠模型，觀察小鼠腫瘤生長情況，行免疫組織化學檢測腫瘤組織中MUC1表達及其分布特點。6.T739小鼠隨機分為4組，首先用BST739-MUC1細胞，分別皮下接種T739小鼠，2×106細胞/只，7天后第1組相同區(qū)域皮下注射等滲

7、鹽水0.2ml，第2組注射沒有肽刺激的空DC細胞懸液，第3組注射負載13號MUC1模擬表位肽的DC細胞懸液，第4組注射負載14號MUC1模擬表位肽的DC細胞懸液，2×105/只，1周后加強免疫1次，建立T739小鼠膀胱癌治療模型。治療過程中，每1～2日測量腫瘤大小，計算腫瘤體積，治療2周后，切取瘤組織稱瘤重，并觀察剩余小鼠存活期。7.依據(jù)模擬表位基因序列，選取Ecoli大腸桿菌偏好密碼子合成目的基因片段，合成目的基因片段進行自連，選用最

8、大重復序列目的片段克隆入PET-31b(+)高效表達載體，克隆PCR和測序鑒定，選用插入最大目的片段的重組質粒進一步轉化表達宿主菌BLR(DE3)plysS，用IPTG進行誘導表達，并對表達條件進行優(yōu)化，以獲得融合蛋白的高效表達，用Ni2+親和層析柱對目的蛋白進行純化，收集純化蛋白樣品，Western印跡鑒定。 結果：1.從噬菌體隨機肽庫中篩選獲得兩個MUC1的模擬表位，能特異性與單克隆抗體BC2結合，同MUC1核心肽表位序列A

9、PDTR進行比較，無同源性，表位預測顯示13號肽序列包含有與HLA-B*0702、HLA-B*08等MHCⅠ類分子較好結合的表位，14號肽序列包含有與HLA-A*0201、HLA-B*5101等MHCⅠ類分子較好結合的表位，預測分值均較高。合成的模擬表位肽能競爭抑制MUC1單克隆抗體與MUC1抗原的結合，兩個肽濃度為50ug/mL時幾乎完全抑制抗原抗體結合。2.建立穩(wěn)定表達人MUC1的T739小鼠膀胱癌細胞株，基因組PCR、RT-PCR

10、、免疫組化、流式細胞儀從DNA、mRNA和蛋白質水平證實人MUC1基因整合在細胞基因組中并穩(wěn)定表達MUC1，MUC1主要表達于胞膜和胞漿，與親代細胞相比，BST739-MUC1體外生長特性無明顯改變。3.從T739小鼠骨髓細胞中誘導、培養(yǎng)出成熟DC，光鏡下觀察培養(yǎng)7天的成熟DC，可見具有典型的DC形態(tài)，流式細胞儀鑒定其純度為78.8％。4.ELISA檢測結果顯示兩個肽免疫的T739小鼠血清產(chǎn)生的特異性抗體活性明顯高于兩個PBS和DC+P

11、BS免疫后小鼠，相差非常顯著(p＜0.01)，表明兩個肽免疫的T739小鼠體內產(chǎn)生了MUC1特異性抗體。ELISPOT結果顯示，兩個肽免疫的T739小鼠特異性分泌IFN-γ的T細胞頻數(shù)分別是92±10.5、106.5±12.8，而PBS和DC+PBS免疫后小鼠特異性分泌IFN-γ的T細胞頻數(shù)均少于10，數(shù)量明顯少于前兩個組，表明兩個肽免疫的T739小鼠脾臟細胞中，產(chǎn)生了特異性活化的T淋巴細胞?；罨钠⑴K淋巴細胞的細胞毒效應檢測顯示效靶比

12、為25∶1開始顯示溶破效應，當效靶比為100∶1時兩個肽免疫的T739小鼠產(chǎn)生的活化T淋巴細胞具有顯著細胞毒功能，與PBS和DC+PBS免疫小鼠相比，相差非常顯著(p＜0.01)。5.兩組小鼠背部皮下注射BST739-PC細胞或BST739-MUC1細胞7天左右所有T739小鼠均生長出皮下腫瘤，成瘤率100％，兩組腫瘤生長情況無明顯差別，第30天以后小鼠開始陸續(xù)死亡，接種BST739-MUC1小鼠平均生存時間稍長于接種BST739小鼠。

13、免疫組化檢測結果同培養(yǎng)的轉染BST739-MUC1細胞和BST739-PC細胞免疫組化檢測結果一致。6.在T739小鼠膀胱癌治療模型中，治療前各組之間的瘤體積大小基本保持一致，治療1周后，第1-4組腫瘤平均體積分別是690.7231±66.9365mm3，766.4980±150.7123mm3，514.8932±140.8419mm3，474.1843±81.5392mm3，與DC+PBS組和PBS組相比，以DC+肽免疫的兩組小鼠瘤體

14、積開始縮小，治療2周后，第1-4組腫瘤平均體積分別是2440.318±110.2717mm3，2361.863±265.4752mm3，1277.716±94.0457mm3，1043.940±72.8229mm3，兩組DC+肽免疫的小鼠瘤體積減小更加明顯，與DC+PBS組和PBS組相比差異非常顯著(p＜0.01)。治療2周后，第1-4組平均瘤重分別為2.942±0.34克，3.162±0.225克，1.728±0.295克，1.408

15、±0.215克，1、2組與3、4組相比差異非常顯著(p＜0.01)，第2-4組抑瘤率分別為6.96％、41.26％、52.14％，第1-4組荷瘤鼠的生存期分別為34.6±3.507天，35.2±3.564天，58.4±5.595天，59±6.819天，DC+肽免疫的兩組荷瘤小鼠生存期較PBS+DC組和等滲鹽水組明顯延長，差異有顯著性意義(p＜0.01)。7.磷酸化的目的基因片段直接退火自連后，凝膠電泳鑒定至少連上2個重復序列。PET-3

16、1b(+)質粒去磷酸化并酶切，用最大重復序列目的片段與PET-31b(+)載體連接，克隆PCR和測序結果說明有兩個目的片段插入重組質粒載體，選用此重組質粒進一步轉化高效表達菌BLR(DE3))plysS，在0.1mMIPTG，30℃，誘導3小時后，蛋白電泳見可13號和14號兩個MUC1模擬表位融合蛋白表達，表達蛋白的分子量與理論值(18×103D)相符，在0.5mMIPTG，37℃，誘導4-6小時，MUC1模擬表位融合蛋白在包涵體內可得

17、理想表達。用Ni2+親和層析柱對目的蛋白進行純化，15％SDS-PAGE電泳結果可見清晰特異性蛋白條帶，Westernblot檢測，MUC1模擬表位顯色條帶與SDS-PAGE電泳圖純化蛋白位置相對應，證明所表達蛋白的特異性，并具有良好的抗原性。 結論：篩選到兩個MUC1的模擬表位，建立了穩(wěn)定表達人MUC1的小鼠膀胱移行細胞癌細胞株及相關腫瘤模型。負載兩個模擬表位肽的DC免疫小鼠，體內外均可誘導機體產(chǎn)生特異性細胞和體液免疫應答，在