MUC1模擬表位肽疫苗預防和治療膀胱癌的實驗研究.pdf

1、目的：觀察MUC1糖鏈和肽鏈表位在腎臟和膀胱腫瘤中的表達，篩選MUC1糖鏈表位的模擬肽，研究模擬表位肽疫苗誘導T739小鼠產生功能性免疫應答及預防和治療膀胱癌的作用。 材料與方法：1)免疫組化二步法檢測MUC1糖鏈和肽表位在腎癌及膀胱癌中的表達、分布及其與細胞類型、腫瘤分期分級的關系；2)篩選噬菌體隨機12肽庫，獲得與識別MUC1糖鏈表位的單克隆抗體Ma695結合的模擬肽；流式細胞儀鑒定模擬肽的競爭抑制效應；分離小鼠脾臟單個核細

2、胞，在GM-CSF和IL-4條件下培養(yǎng)獲得樹突狀細胞，LPS促其成熟，F(xiàn)CM鑒定其純度；負載模擬肽的成熟樹突狀細胞免疫T739小鼠后，用ELISA、ELISPOT等方法觀察模擬肽誘導與原表位交叉反應的體液免疫應答和特異性細胞免疫應答；非放射性乳酸脫氫酶法檢測體外細胞毒活性；3)利用脂質體介導的方法，在BST739中轉入人MUC1全長cDNA，經G418篩選和克隆化培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達MUC1的T739小鼠膀胱癌細胞亞系BST739-MUC

3、1，PCR、RT-PCR、免疫組化、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、免疫印跡等鑒定MUC1基因和蛋白的表達及分布，觀察轉入人MUC1對腫瘤細胞黏附和體內外生長的影響；4)建立小鼠膀胱移行細胞癌預防和治療模型，觀察模擬表位肽疫苗的預防和治療作用。結果：1)MUC1在85.5％的腎臟腫瘤和100％的移行細胞癌中表達，陽性細胞數(shù)及分布模式與腫瘤分期分級相關。2)篩選噬菌體隨機肽庫獲得MUC1糖鏈表位的模擬表位肽M1，能競爭抑制Ma695與MUC

4、1+腫瘤細胞MCF7的結合。當細胞數(shù)為2×105、Ma695濃度為0.25μg/ml、Ml肽濃度為100、200、400、800μg/ml時，抑制率分別為11％、26％、26％和34％；脾臟單個核細胞培養(yǎng)7天獲得具有典型形態(tài)特征的樹突狀細胞，F(xiàn)CM顯示其純度為83.2％；負載M1肽的DC免疫小鼠后，誘導特異性CTL應答，ELISPOT結果表明，活化的特異性T細胞為脾臟淋巴細胞的116/105；同時誘導產生M1肽特異性抗體，能與MUC1+

5、腫瘤細胞結合，但不與MUC1-細胞結合；3)基因組PCR、RT-PCR、免疫組化和免疫印跡從DNA、mRNA和蛋白質水平證實外源基因整合在細胞基因組中并穩(wěn)定表達MUC1，激光共聚焦顯微鏡顯示MUC1彌漫分布于胞膜和胞漿；與親代細胞相比，BST739-MUC1體外黏附力增加44％，體外生長特性無明顯改變，但在同系小鼠體內腫瘤早期生長較快，第18天時腫瘤平均體積為2744±948mm3(vs808±322mm3，p=0.0013)；從第18

6、天開始，腫瘤生長速度減慢；小鼠可自發(fā)排斥表達人MUC1的BST739-MUC1細胞。4)負載M1肽的DC免疫后，效靶比為100：1時，小鼠脾臟淋巴細胞能溶破18.9％～29.5％的BST739-MUC1，具有一定的抗腫瘤活性；預防模型中，M1肽能延緩腫瘤生長，腫瘤重量僅為對照組的14.4％(1.7±0.8mgvs11.8±4.8mg)；小鼠血清M1肽特異性抗體濃度升高167％(1.52±0.54vs0.57±0.21)，CTL活性升高1

7、22％(17.3％vs7.8％)；治療模型中，M1肽能使小鼠生存時間延長50％(44±5.7天vs30±1.6天，p=0.0031)，抗體濃度升高338％(1.71vs0.39)，CTL活性升高71％(19.5％vs11.4％)。結論：1).MUC1異常表達在腎癌和膀胱癌中十分常見，與腫瘤分期、分級和細胞類型有良好的相關性，是RCC和TCC免疫治療的靶標之一。2).建立穩(wěn)定表達人MUC1的小鼠膀胱移行細胞癌細胞系及相關腫瘤模型；3).篩