肌肉注射Ag85A DNA疫苗對(duì)膀胱癌小鼠T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞活性的影響.pdf

1、膀胱癌是我國(guó)泌尿外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，以淺表性膀胱癌多見(jiàn)。臨床治療中常在經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TURBT)后，用卡介苗(BCG)進(jìn)行膀胱腔內(nèi)灌注來(lái)預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)或治療原位癌，該法是目前最成功的免疫治療方法。但BCG灌注在多數(shù)患者中有無(wú)菌性膀胱炎、血尿、發(fā)熱等副作用，也有少部分患者對(duì)此法表現(xiàn)無(wú)反應(yīng)性。因此，有必要研究開(kāi)發(fā)BCG的有效成分用以替代BCG進(jìn)行膀胱癌的治療。 Ag85復(fù)合物是BCG、結(jié)核分枝桿菌及其它分枝桿菌主要的外分泌

2、蛋白，由Ag85A、Ag85B和Ag85C三種蛋白分子組成，分子量為30～32kDa。以Ag85A為基礎(chǔ)制備的DNA疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中明顯上調(diào)了機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。 細(xì)胞免疫是BCG抗膀胱癌免疫的主要機(jī)制。BCG灌注后可以募集單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)至膀胱局部，其中CD4+T細(xì)胞主要通過(guò)釋放IL-2、IL-12和IFN-γ等細(xì)胞因子介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)發(fā)揮抗腫瘤作用；CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)等主要是通過(guò)

3、細(xì)胞殺傷作用發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。也有報(bào)道認(rèn)為NK細(xì)胞在BCG介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中作用更為重要。 本實(shí)驗(yàn)將Ag85ADNA疫苗肌肉注射給荷MBT-2膀胱癌小鼠，觀察了該疫苗對(duì)小鼠T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞活性的影響，為確認(rèn)單一應(yīng)用Ag85ADNA疫苗是否能替代BCG用于膀胱癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法用堿裂解法從JM109菌中大量提取Ag85A-V1Jns.tpA質(zhì)粒和V1Jns.tpA質(zhì)粒，聚乙二醇法純化，0.8％瓊脂糖凝膠

4、電泳鑒定，調(diào)整濃度為1g/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?將1×106個(gè)MBT-2細(xì)胞接種于6-8周齡C3H/HeN雌性小鼠右側(cè)背部皮內(nèi)，待腫瘤直徑達(dá)約5-8mm時(shí)將動(dòng)物隨機(jī)分成Ag5A-V1Jns.tPA組(實(shí)驗(yàn)組)、V1Jns.tPA組(空質(zhì)粒組)和空白對(duì)照組(生理鹽水組)，于小鼠雙側(cè)股四頭肌肌肉注射共100μl(含100μg)質(zhì)?；蛳嗤萘康纳睇}水。每2周免疫一次，共三次。于末次免疫后2周，殺鼠制備脾細(xì)胞懸液，用FITC-CD4

5、熒光標(biāo)記抗體和PE-CD8熒光標(biāo)記抗體標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。同時(shí)用乳酸脫氫酶法測(cè)定NK細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)各組小鼠脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞亞群所占的百分比及CD4+/CD8+的比值，分別為：實(shí)驗(yàn)組是8.91±6.27％、6.57±2.83％和1.26±0.34；空質(zhì)粒組是6.53±3.50％、5.20±1.37％和1.21±0.37；生理鹽水組是

6、11.94±3.74％、8.97±1.92％和1.31±0.23。各組間比較均未見(jiàn)顯著性差異(P＞0.05)。NK細(xì)胞活性分別是實(shí)驗(yàn)組19.07±5.8％、空質(zhì)粒組11.16±10.01％和生理鹽水組22.06±6.02％，各組間也未見(jiàn)有顯著性差別(P＞0.05)。 討論在抗腫瘤免疫中，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫占主導(dǎo)作用。由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫主要是通過(guò)CD4+輔助性T細(xì)胞(Th1細(xì)胞)和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)實(shí)現(xiàn)的。NK

7、細(xì)胞是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)重要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，在BCG抗膀胱癌治療中發(fā)揮重要作用。 Ag85ADNA疫苗進(jìn)入機(jī)體后可以激活抗原特異性的CTL和Th1型T細(xì)胞，二者均可釋放IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以進(jìn)一步活化NK細(xì)胞。以上細(xì)胞和細(xì)胞因子均起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。到目前為止尚未見(jiàn)有關(guān)單一應(yīng)用Ag85ADNA疫苗對(duì)荷瘤動(dòng)物，特別是膀胱癌動(dòng)物治療效果及免疫功能變化方面的研究報(bào)道。我們應(yīng)用單一的Ag85ADNA疫苗，其

8、表達(dá)產(chǎn)物可能不足以誘導(dǎo)荷瘤鼠免疫功能的提高，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的效果。 DNA疫苗的接種方法及途徑將影響其所含目的基因的表達(dá)、抗原的提呈及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類(lèi)型。本研究中采用的是直接肌肉注射法，未見(jiàn)細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)。這可能與動(dòng)物的品系及所選用的接種方法和途徑有關(guān)。 因此，在應(yīng)用DNA疫苗抗腫瘤的研究中，如何針對(duì)不同性質(zhì)的腫瘤選取有效的抗腫瘤候選基因制備DNA疫苗、選擇何種免疫方法和途徑，需進(jìn)行多方面的綜合考慮。 結(jié)論