Ag85A DNA疫苗對膀胱癌荷瘤鼠淋巴細胞增殖能力和FasL mRNA表達水平的影響.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在男性常見腫瘤中居第四位，女性常見腫瘤中居第十位。膀胱癌90％以上為移行上皮細胞癌，有相當一部分為淺表性膀胱癌。用卡介苗(BCG)進行膀胱腔內灌注來預防膀胱癌復發(fā)或治療原位癌是至今最成功的免疫療法之一。但相當數(shù)量的患者對BCG治療無效或在治療中產生副作用。因此有必要尋找一種更有效、更安全的制劑替代此種療法。 Ag85復合物主要由分子量為30-32kDa的Ag85A、Ag85B、Ag85C三種

2、蛋白質組成，是結核分枝桿菌分泌蛋白和BCG培養(yǎng)濾液的主要成分。其中Ag85A可能是細菌生長和維持毒力的最重要成分。用編碼Ag85A的DNA疫苗免疫小鼠，可誘導小鼠產生強烈的Th1型免疫應答和CD8T細胞介導的細胞毒性免疫應答，并能抵御經氣溶膠或靜脈內結核桿菌攻擊，提示編碼Ag85A的DNA免疫可誘生較結核桿菌感染更強烈、更廣泛的T細胞應答。 本實驗通過給C3H/HeN小鼠皮內接種MBT-2細胞建立移植性膀胱癌模型，再經肌肉注射A

3、g85ADNA疫苗，探討該疫苗對荷瘤鼠T細胞免疫應答，尤其是對細胞毒性T細胞殺傷活性的影響，為Ag85ADNA疫苗可否用于膀胱癌的治療提供實驗依據(jù)。 實驗材料和方法用堿裂解法從轉化后的JM109大腸桿菌中提取Ag85A-V1Jns.tpA質粒和V1Jns.tpA質粒，用BglⅡ限制性內切酶酶切質粒，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果。用堿裂解法大量提取質粒后用聚乙二醇法純化質粒，調整濃度為1g/L，保存在-20℃。 6-8周齡的C

4、3H/HeN雌性小鼠(18-20g)，隨機分成實驗組(Ag85A-V1Jns.tPA組)，空質粒組(V1Jns.tPA組)和生理鹽水組三組，將1×106個MBT-2細胞接種于小鼠右側背部皮下，待腫瘤直徑長出約5-7mm后，于小鼠股四頭肌肌肉注射100μL濃度為1g/L的Ag85A-V1Jns.tPA，V1Jns.tPA或100μL的生理鹽水，每14天一次，重復3次。于末次免疫后第14天，殺鼠，迅速剝離背部腫瘤，去除腫瘤表面覆蓋的皮膚，逐

5、個稱取瘤重。無菌取脾，進行細胞培養(yǎng)。MTT法檢測脾淋巴細胞增殖能力。并取1mL脾淋巴細胞懸液，用Trizol法提取脾淋巴細胞總mR-NA，用UV300紫外分光光度計測定總RNA純度及濃度。以總RNA為模板反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，以管家基因β-actin為內參照，PCR擴增小鼠FasL基因片斷。PCR擴增產物經1.5％的瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠(EB)染色后，用ChemiImager5500凝膠圖像分析儀進行掃描分析。Fas

6、LmRNA的表達水平用所測定的擴增產物FasL的電泳條帶密度與β-actin電泳條帶密度的比值來表示。用t檢驗進行顯著性分析。 實驗結果從JM109大腸桿菌中提取Ag85A-V1Jns.tPA質粒和V1Jns.tPA空質粒，用BglⅡ限制性內切酶消化，然后經0.8％瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后掃描后顯示，質粒中存在Ag85A的基因片段(1014bp)。 末次免疫后第14天，Ag85ADNA質粒組的淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)，

7、荷瘤鼠脾淋巴細胞FasLmRNA的表達水平以及瘤重與空質粒對照組、正常對照組之間相互比較，均未見顯著性差異(p＞0.05)。 討論DNA疫苗指由編碼抗原的基因與啟動子和終止子組成的并能在哺乳動物細胞內表達的環(huán)狀DNA。DNA進入細胞并在細胞內表達、分泌抗原，以類似自然感染的方式進行抗原提呈，全面誘導特異性體液和細胞免疫應答。在很多難治性感染性疾病，自身免疫性疾病，過敏性疾病和腫瘤性疾病的動物模型上，顯示了良好的預防和治療的前景。

8、 在我們的實驗中，肌肉注射Ag85ADNA疫苗后，未見脾細胞FasLmRNA的表達增加，MBT-2荷瘤鼠模型的脾淋巴細胞增殖能力也未見增強。此結果與各組移植瘤的生長情況相一致。這一結果提示，荷瘤鼠脾淋巴細胞未受到Ag85A抗原的足夠刺激，使其增殖能力增強。分析其原因可能為：按本研究的實驗方法經肌肉注射Ag85ADNA疫苗，荷瘤鼠體內未能產生足夠的蛋白表達量；單獨應用Ag85ADNA疫苗所表達的Ag85A蛋白分子不能刺激免疫細胞功