樹突狀細(xì)胞疫苗影響hu-PBL-SCID鼠膀胱癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人膀胱癌細(xì)胞株高侵襲性亞群的體外篩選。目的：利用體外模型篩選人侵襲性膀胱癌細(xì)胞株T24的高侵襲性亞群，并觀察其體外侵襲能力與運(yùn)動(dòng)能力的變化。方法：采用改良的Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)方法，在體外經(jīng)三次，篩選出人侵襲性膀胱癌細(xì)胞株T24的高侵襲性亞群，命名為T24-Ⅲ。繪制子代細(xì)胞T24-Ⅲ與母代細(xì)胞T24的體外生長(zhǎng)曲線，用改良的Boyden小室比較這兩種細(xì)胞的體外侵襲能力與體外運(yùn)動(dòng)能力，熒光定量RT-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞的MMP-7

2、mRNA表達(dá)水平。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)用改良的Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)成功地篩選出了人侵襲性膀胱癌細(xì)胞株T24的高侵襲性亞群T24-Ⅲ，其體外侵襲力與體外趨化性運(yùn)動(dòng)能力均強(qiáng)于母代細(xì)胞T24；兩種細(xì)胞的體外侵襲力與體外趨化性運(yùn)動(dòng)能力呈正相關(guān)；體外培養(yǎng)條件下，二者的MMP7mRNA表達(dá)水平無(wú)明確差異。 第二部分hu-PBL-SCID鼠膀胱癌模型的建立及其生物學(xué)特性觀察。目的：建立人外周血淋巴細(xì)胞免疫重建的SCID鼠膀胱癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型，觀察

3、體外篩選獲得的人膀胱癌細(xì)胞株高侵襲性亞群T24-Ⅲ細(xì)胞與其母代細(xì)胞T24的體內(nèi)侵襲與轉(zhuǎn)移情況，并評(píng)價(jià)該模型用于DCs疫苗干預(yù)膀胱癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的可行性。方法；經(jīng)過(guò)滲漏篩查的SCID鼠20只，隨機(jī)分為兩組，每組10只，分別為T24-Ⅲ細(xì)胞組與T24細(xì)胞組，都經(jīng)腹腔注射兔AntiasialoGM1，再將密度梯度離心法分離的健康人外周血淋巴細(xì)胞，以4×107個(gè)·只-1的劑量，經(jīng)腹腔注射，并在小鼠的右后肢大腿內(nèi)側(cè)皮下，分別注射T24-Ⅲ細(xì)胞與T

4、24細(xì)胞，3×106個(gè)·只-1。于第2周末，每組分別處死2只鼠，于第4、5周末每組各處死4只鼠。處死鼠時(shí)，觀察鼠的各臟器大體解剖，取外周血、脾臟、瘤體、右側(cè)腹股溝淋巴結(jié)、右側(cè)髂血管旁淋巴結(jié)+右側(cè)腎門淋巴結(jié)。用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中人IgG表達(dá)；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血與脾臟中CD3+、CD4+、CD8+的細(xì)胞；稱瘤重，一半瘤體作普通病理檢查，另一半用于RT-PCR檢測(cè)；淋巴結(jié)標(biāo)本分為兩組，一組為腹股溝淋巴結(jié)、另一組為髂血管旁淋巴結(jié)與腎

5、門淋巴結(jié)，各組標(biāo)本一半作普通病理檢查，另一半分別用于RT-PCR，定性法檢測(cè)了人CK20mRNA與人hTERTmRNA的表達(dá)，熒光定量法檢測(cè)了人CK20mRNA與人GAPDHmRNA的表達(dá)。結(jié)論：T24-Ⅲ細(xì)胞的體內(nèi)侵襲能力與轉(zhuǎn)移能力也強(qiáng)于T24細(xì)胞，二者體內(nèi)MMP-7mRNA表達(dá)無(wú)明確差異；MMP-7mRNA的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲范圍呈正相關(guān)；用健康人外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)腹腔注射可以在荷瘤SCID鼠體內(nèi)成功地進(jìn)行免疫重建；所建立的hu-P

6、BL-SCID鼠膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型于第5周末出現(xiàn)較高水平的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。 第三部分樹突狀細(xì)胞疫苗治療hu-PBL-SCID鼠膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究。目的：通過(guò)觀察全腫瘤細(xì)胞抗原致敏的樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)hu-PBL-SCID鼠膀胱癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的影響，尋求DCs疫苗用于治療腫瘤微轉(zhuǎn)移、控制腫瘤擴(kuò)散及延緩轉(zhuǎn)移灶形成的可能性。 方法：經(jīng)過(guò)滲漏篩查的SCID鼠12只，都經(jīng)腹腔注射兔AntiasialoGM1，用密度梯度離心法分離的健康

7、人外周血淋巴細(xì)胞，以4×107個(gè)·只-1的劑量，經(jīng)腹腔注射，并在小鼠的右后肢大腿內(nèi)側(cè)皮下注射T24-Ⅲ細(xì)胞，3×106個(gè)·只-1，制成hu-PBL-SCID鼠膀胱癌模型。另取T24-Ⅲ細(xì)胞，反復(fù)凍融法提取全腫瘤細(xì)胞抗原，再次用密度梯度離心法分離的健康人外周血淋巴細(xì)胞，在rhGM-CSF1000ng·ml-1、rhIL-420ng·ml-1、rhTNF-α50ng·ml-1及所提取的全腫瘤細(xì)胞抗原的作用下誘導(dǎo)并擴(kuò)增出DCs疫苗，倒置顯微鏡

8、觀察形態(tài)，并用流式細(xì)胞儀分析表型。將實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，于接種T24-Ⅲ細(xì)胞的第5周末與第6周末，在hu-PBL-SCID鼠的右側(cè)腹股溝皮下分別注射0.1ml的PBS、未致敏的DCs(1×106·0.1mF1)與DCs疫苗(1×106·0.1ml-1)。于第7周末處死各鼠，用普通病理檢查和熒光定量RT-PCR，觀察轉(zhuǎn)移灶的形成及淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。結(jié)論：初步觀察發(fā)現(xiàn)，全腫瘤細(xì)胞抗原致敏的樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)hu-PBL-SCID鼠膀胱癌