口服Ag85A DNA疫苗誘導(dǎo)腸道IEL亞群及其生物學(xué)活性的變化.pdf

1、目的:今年年初世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2009年全球結(jié)核病控制報(bào)告》中指出，目前全球結(jié)核菌感染人數(shù)超過20億，其中結(jié)核病患者或可能發(fā)病者約占1/10。我國(guó)約有5.5億人已經(jīng)感染結(jié)核桿菌，現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核患者約450萬(wàn)。全世界耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病例數(shù)約為50萬(wàn)，我國(guó)是其中總數(shù)排名前五位的高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。目前卡介苗(BCG)作為唯一臨床使用的疫苗，預(yù)防效果并不穩(wěn)定。因此研制新疫苗成為當(dāng)前結(jié)核病防治的首要任務(wù)。
　　 BCG作為一種減毒

2、活疫苗，除用于預(yù)防結(jié)核病外，也作為一種強(qiáng)的非特異性細(xì)胞免疫刺激劑，用于腫瘤(如膀胱癌等)的治療。研究還證明BCG與動(dòng)物和人等一些腫瘤細(xì)胞間存在著共同抗原。但BCG灌注治療膀胱癌的毒副作用也常使部分患者因不能耐受其副作用而不得不終止BCG灌注治療。
　　 Ag85復(fù)合物是由A、B、C三種成分組成，存在于結(jié)核桿菌和BCG等分枝桿菌的細(xì)胞壁及培養(yǎng)濾液中。在BCG Ag85的三種成分中Ag85A所占的比例最大，而且多項(xiàng)研究表明Ag85A

3、抗原是一種十分重要的免疫保護(hù)性抗原。近年來的研究表明，Ag85A可使小鼠脾CD8+CTL的細(xì)胞毒活性增強(qiáng)，可刺激機(jī)體Th1型細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-α等的產(chǎn)生水平升高；促進(jìn)NK細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。但由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，并且需要較復(fù)雜生長(zhǎng)條件，從細(xì)菌菌體中提取Ag85A蛋白易發(fā)生凝集和降解，更難于純化。同時(shí)Ag85A作為一種異種蛋白質(zhì)長(zhǎng)期使用仍有可能發(fā)生變態(tài)反應(yīng)等不良反應(yīng)。1996年Huyg

4、en等[23]首次報(bào)道用結(jié)核分支桿菌Ag85A編碼基因的質(zhì)粒DNA經(jīng)肌肉接種途徑免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生很強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，抵御結(jié)核分支桿菌的攻擊。
　　 自90年代初首次報(bào)道應(yīng)用DNA疫苗進(jìn)行免疫以來，大量的研究已經(jīng)顯示了DNA疫苗的實(shí)際效果和廣闊的應(yīng)用前景。近些年來已將DNA疫苗的應(yīng)用研究擴(kuò)展到了抗感染、抗腫瘤、治療變態(tài)反應(yīng)性疾病和自身免疫病及降低組織器官移植排斥反應(yīng)等多個(gè)領(lǐng)域。DNA疫苗可經(jīng)多種途徑(如粘膜、皮膚和肌

5、肉等)和采用多種方式(如口服、噴霧和注射等)接種，依據(jù)所含目的基因及表達(dá)產(chǎn)物的不同可致機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答上調(diào)或下調(diào)及免疫應(yīng)答的類型不周。經(jīng)口服進(jìn)行DNA疫苗接種是一種簡(jiǎn)便、易于被人們接受的方式。但口服DNA疫苗在黏膜局部的表達(dá)情況和誘導(dǎo)局部的免疫細(xì)胞，特別是IEL的變化，目前尚不清楚。為此，我們采用經(jīng)口灌飼的方式給小鼠投與自制的Ag85A DNA疫苗，在觀察腸道局部細(xì)胞表達(dá)的基礎(chǔ)上，對(duì)其誘導(dǎo)的IEL亞群及生物學(xué)功能的變化進(jìn)行了研究，目的是

6、探討經(jīng)口服途徑接種分枝桿菌Ag85A DNA疫苗有否預(yù)防和治療效應(yīng)。
　　 材料與方法
　　 1、重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A的構(gòu)建
　　 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增Ag85A基因片段，與真核表達(dá)pcDNA3.1/myc-hisA質(zhì)粒載體連接成重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，于-70℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、Ag85A DNA疫苗的制備

7、r>　　 采用V-gene無內(nèi)毒素型超純質(zhì)粒DNA制備試劑盒分離純化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒。采用電穿孔轉(zhuǎn)化法將pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到減毒傷寒沙門氏菌ST7207菌苗，經(jīng)大量培養(yǎng)細(xì)菌制成由減毒傷寒菌苗攜帶的Ag85ADNA疫苗。
　　 同時(shí)將純化的pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒用脂質(zhì)LipofectamineTM2000包裹，制成脂質(zhì)體

8、包裹的Ag85A DNA疫苗。
　　 3、動(dòng)物分組與免疫
　　 檢測(cè)Ag85A DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠腸IEL亞群的變化：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組，即重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和正常對(duì)照組。每只鼠免疫3次，前二次免疫間隔10天，后二次免疫間隔14天。重組質(zhì)粒組前二次經(jīng)口灌飼脂質(zhì)體包裹Ag85ADNA疫苗，后一次經(jīng)口灌飼減毒傷寒菌-Ag85ADNA疫苗。同樣方法分別給后二組小鼠口灌飼減毒傷寒菌-pcDNA3.1菌和生理鹽水作

9、為對(duì)照。末次免疫后3周檢測(cè)IEL亞群。
　　 檢測(cè)Ag85ADNA疫苗誘導(dǎo)小鼠腸IEL的生物學(xué)功能變化：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組，即重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和正常對(duì)照組。每只鼠免疫2次，間隔2周。重組質(zhì)粒組經(jīng)口灌飼減毒傷寒桿菌-Ag85A DNA疫苗菌液；空質(zhì)粒組和正常對(duì)照組以同樣方法分別經(jīng)口灌飼減毒傷寒桿菌-V1Jns.tPA菌和生理鹽水。末次免疫后的第1、3、6、9和12d處死小鼠進(jìn)行IEL生物學(xué)功能檢測(cè)。
　　

10、 4、IEL的分離
　　 去小鼠全部小腸，翻轉(zhuǎn)，截成數(shù)段，清洗干凈；加消化液于37℃恒溫振蕩；靜置片刻后，去含游離細(xì)胞的上層液通過紗布及玻璃棉柱，再用淋巴細(xì)胞分層液分離。
　　 5、IEL細(xì)胞亞群的檢測(cè)
　　 采用流式細(xì)胞分析儀分析測(cè)定T細(xì)胞亞群。
　　 6、IEL的培養(yǎng)
　　 將IEL調(diào)成所需細(xì)胞濃度，加終濃度為5μg/ml Ag85A蛋白孵育48小時(shí)，離心收集培養(yǎng)上清液，用于細(xì)胞因子的測(cè)定。<

11、br>　　 7、細(xì)胞因子的檢測(cè)
　　 采用生物活性測(cè)定法(依賴細(xì)胞株檢測(cè)法)檢測(cè)IEL培養(yǎng)上清中的IL-2；采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β。
　　 8、FasL分子表達(dá)的檢測(cè)
　　 提取IEL總RNA，采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)FasL mRNA的表達(dá)。FasLmRNA的表達(dá)水平用所測(cè)定的擴(kuò)增產(chǎn)物FasL的電泳條帶密度與β-actin電泳條帶密度的比值表示。

12、>　　 9、細(xì)胞毒活性檢測(cè)
　　 采用放射核素釋51Cr釋放法。將IEL先用絲裂霉素處理的轉(zhuǎn)染Ag85A cDNA的p815細(xì)胞刺激，然后與靶細(xì)胞(51Cr標(biāo)記的P815細(xì)胞)共孵育一定時(shí)間，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定培養(yǎng)上清中的放射活性cpm值。計(jì)算細(xì)胞毒活性。計(jì)算公式：細(xì)胞毒活性(％)=(IEL孔釋放cpm值-自然釋放孔cpm值/最大釋放孔cpm值-自然釋放孔cpm值)x100％
　　 10、細(xì)胞增殖活性檢測(cè)
　　 采

13、用放射性核素[3H]thymidine攝入法檢測(cè)IEL的增殖活性。將IEL用終濃度為5μg/mlAg85A蛋白刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入[3H]thymidine，將培養(yǎng)的細(xì)胞收集細(xì)胞至玻璃纖維濾膜上，將玻璃纖維濾膜放入液體閃爍液內(nèi)，用β液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定cpm值。計(jì)算刺激指數(shù)公式：刺激指數(shù)=實(shí)驗(yàn)孔cpm值-空白對(duì)照孔cpm值/空白對(duì)照孔cpm值。
　　 11、腸組織SIgA水平測(cè)定
　　 采用SIgA放免分析試劑盒測(cè)定腸

14、組織SIgA水平。剪取小腸中段約5cm，縱行剖開，洗凈剪碎，每克腸組織加入10ml生理鹽水，制成勻漿，離心取上清液。然后按說明書進(jìn)行測(cè)定。
　　 結(jié)論:
　　 1、轉(zhuǎn)化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A和pcDNA3.1/myc-hisA減毒傷寒沙門氏菌成功。
　　 2、經(jīng)口接種Ag85A DNA疫苗誘導(dǎo)了CD3+CD8αβ+IEL、CD3+CD8αα+IEL、CD3+TCRγδ+IEL和CD103+

15、IEL的比例升高，CD25+IEL和Foxp3+IEL比例降低，CD3+IEL和CD3+TCRαβ+IEL的數(shù)量未見明顯變化，提示經(jīng)口途徑投與Ag85ADNA疫苗可能主要誘導(dǎo)CD8+CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，而不是誘導(dǎo)免疫耐受。
　　 3、經(jīng)口接種Ag85A DNA疫苗可誘導(dǎo)IEL的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-β分泌水平增加；IL-4水平無變化；特異性細(xì)胞毒活性增強(qiáng)；FasL表達(dá)增加；IEL特異性增殖活性增