梅毒螺旋體Tp92蛋白的抗原表位篩選與鑒定.pdf

1、目的：篩選和鑒定梅毒螺旋體(Treponema pallidum, Tp)Tp92蛋白的B、Th和聯(lián)合B-Th細(xì)胞抗原表位，為深入探討這些表位在梅毒表位疫苗中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　(1)從GenBank獲取Tp92蛋白氨基酸序列，預(yù)測其信號(hào)肽序列；采用親水性、柔韌性、抗原指數(shù)及表面可能性方案，以IEDB和Bcepred軟件分析工具綜合預(yù)測Tp92蛋白的B細(xì)胞表位；以RANKPEP、SYFPEITHI軟件預(yù)測綜合預(yù)

2、測Tp92蛋白的HLA-DRBl限制性Th細(xì)胞表位；根據(jù)上述結(jié)果綜合預(yù)測Tp92蛋白的聯(lián)合B-Th細(xì)胞表位。
　　(2) RP—HPLC人工合成和純化預(yù)測的表位多肽，質(zhì)譜分析和鑒定合成多肽。
　　(3)以梅毒患者血清(同時(shí)設(shè)健康人血清對照)，用間接ELISA鑒定預(yù)測Tp92蛋白的B細(xì)胞表位或聯(lián)合B-Th細(xì)胞抗原表位。
　　(4)分離培養(yǎng)梅毒患者和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，以預(yù)測合成的Th或聯(lián)合 Th-B細(xì)胞抗

3、原表位刺激培養(yǎng)的PBMC，同時(shí)設(shè) ConA(陽性對照)和RPMI-1640(陰性對照)刺激，用CCK-8淋巴細(xì)胞增殖試劑盒檢測培養(yǎng)PBMC中淋巴細(xì)胞增殖水平，鑒定Tp92中預(yù)測的T細(xì)胞表位；同時(shí)以ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞分泌INF-γ和IL-4的水平，以鑒定Th細(xì)胞表位的類型。
　　結(jié)果：
　　(1)綜合分析計(jì)算機(jī)預(yù)測方案，篩選出P1(Tp9224-39AA)、P2(Tp92332-347 AA)、P3(Tp925

4、20-536 AA)、P4(Tp92575-588 AA)、P5(Tp92103-118 AA)、P6(Tp92694-712 AA)為Tp92候選B細(xì)胞表位；P5(Tp92103-118 AA)、P6(Tp92694-712 AA)、P7(Tp92668-680 AA)、P8(Tp92300-313 AA)、P9(Tp92396-410 AA)為Tp92候選Th細(xì)胞表位；P5、P6為候選聯(lián)合Th-B表位。
　　(2)經(jīng)RP-HP

5、LC純化及純度分析，合成多肽純度均大于90％；質(zhì)譜分析合成多肽分子量測定值與理論值一致。
　　(3) ELISA分析表明，預(yù)測的P1、P2、P3、P4、P5、P6均與梅毒患者血清反應(yīng)呈陽性，而與健康人血清不反應(yīng)。
　　(4)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，P6、P7、P9能誘導(dǎo)梅毒患者淋巴細(xì)胞明顯增殖，而不能誘導(dǎo)正常人淋巴細(xì)胞增殖；P6、P7、P9誘導(dǎo)梅毒患者淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較高水平IFN-γ；P5、P6、P7、P8、P9均未能誘導(dǎo)梅毒患