梅毒螺旋體Tp0751黏附蛋白的免疫活性及在梅毒致病中的作用研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文梅毒螺旋體Tp0751黏附蛋白的免疫活性及在梅毒致病中的作用研究姓名：劉雙全申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：汪世平20100501博士學(xué)位論文 中文摘要奠定重要的基礎(chǔ)。研究方法通過生物信息學(xué)分析，去除T p 0 7 5 1 信號肽序列，以T PN i c h o l s株的基因組D N A 為模板，P C R 擴(kuò)增T p 0 7 5 l 基因；通過B a m H I 和E c o R I 酶切位點(diǎn)將T p

2、0 7 5 1 基因克隆進(jìn)p E T - 2 8 a ( + ) 質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒，篩選陽性質(zhì)粒，酶切鑒定和P C R 鑒定，經(jīng)測序鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E R 2 5 6 6 中構(gòu)建原核重組表達(dá)體；進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，N i 親合層析柱純化重組蛋白，B C A 法測定蛋白濃度。W e s t e r nb l o t 檢測其免疫反應(yīng)性；用重組蛋白免疫新西蘭兔，檢測兔免疫血清中多克隆抗體的效價(jià)，評價(jià)其免疫原性。利用D e t o x

3、 i ．G e l 內(nèi)毒素去除膠去除重組蛋白中的內(nèi)毒素；將重組蛋白經(jīng)皮下注入新西蘭兔大腿內(nèi)側(cè)，觀察注射部位皮膚變化；佛波酯( P h o r b o l1 2 ．m y r i s t a t e1 3 ．a(chǎn) c e t a t e ，P M A ) 誘導(dǎo)T H P ．I 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，將經(jīng)內(nèi)毒素去除處理后的T p 0 7 5 1 重組蛋白分別刺激巨噬細(xì)胞，通過檢測細(xì)胞的乳酸脫氫酶( 1 a c t a t ed e h y d

4、r o g e n a s e ，L D H ) 漏出率和N O 釋放量研究其細(xì)胞毒性。為研究T p 0 7 5 1 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)作用，以去內(nèi)毒素的T p 0 7 5 1 蛋白刺激n { P 一1 細(xì)胞，檢測其產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子( C K s ) T N F ．僅、I L ．1 1 3和I L ．6 的情況，同時(shí)用L P S 做陽性對照和P B S 為陰性對照組。為了探討誘導(dǎo)C K s 產(chǎn)生的信號傳導(dǎo)通路是否與T L R 2 、C D

5、l 4 、M A P K s 和N F —K B 有關(guān)，分別用T L R 2 抗體、C D l 4 抗體、P D 9 8 0 5 9( E R K l ／2 特異性抑制劑) 、S P 6 0 0 1 2 5 ( S A P K ／J N K 特異性抑制劑) 、S B 2 0 3 5 8 0 ( p 3 8 特異性抑制劑) 和P D T C ( N F ．r ．B 特異性抑制劑) 預(yù)處理T H P ．1 細(xì)胞，然后再用T p 0 7 5