梅毒螺旋體金屬蛋白酶的表達(dá)及對纖維蛋白原水解活性研究.pdf

1、目的:研究梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)金屬蛋白酶Tp0751對細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）纖維蛋白原（Fg）的水解能力及其機制，為深入研究Tp的致病機制提供實驗依據(jù)。
　　方法：(1)Tp0751野生型和突變型蛋白原核表達(dá)、純化：從Genbank上查獲 Tp0751的基因序列(不含信號肽氨基酸編碼序列)，構(gòu)建野生型pET30a(+)/Tp0751、 pET30a(+)/Tp0751 H198A突變型和pET30

2、a(+)/Tp0751 H202A突變型蛋白原核表達(dá)重組載體，重組質(zhì)粒在經(jīng)雙酶切、PCR和測序鑒定后被轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌中進行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；采用 Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，SDS-PAGE鑒定經(jīng)Ni-NTA純化的目的蛋白的表達(dá)形式，BCA法測定蛋白的濃度；Western blot鑒定經(jīng)Ni-NTA純化的目的蛋白。(2)野生型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測：將Tp0751蛋白與Fg按比例混合(蛋白終質(zhì)量為30μg

3、,Fg終質(zhì)量為60μg，反應(yīng)總體積為100μL)，SDS-PAGE檢測Tp0751對Fg不同作用時間段的降解活性。（3）H198A突變型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測：將H198A突變型Tp0751蛋白與Fg按比例混合(蛋白終質(zhì)量為30μg,Fg終質(zhì)量為60μg，反應(yīng)總體積為100μL)，SDS-PAGE檢測H198A突變型Tp0751對Fg不同作用時間段的降解活性。（4）H202A突變型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測：

4、將H202A突變型Tp0751蛋白與Fg按比例混合(蛋白終質(zhì)量為30μg，F(xiàn)g終質(zhì)量為60μg，反應(yīng)總體積為100μL)，SDS-PAGE檢測H202A突變型Tp0751對Fg不同作用時間段的降解活性。
　　結(jié)果：（1）Tp0751蛋白原核表達(dá)、純化：酶切及測序結(jié)果表明重組野生型pET30a(+)/Tp0751質(zhì)粒的插入片段序列與 GenBank上面公布的序列完全一致，經(jīng)兩點法構(gòu)建的突變型重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；該插入片段能夠表達(dá)26K

5、Da大小的可溶性重組蛋白，該重組蛋白經(jīng)純化后的純度達(dá)到90％；該重組蛋白的Western blot結(jié)果表明，其與梅毒陽性病人的免疫血清產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。（2）Tp0751蛋白對Fg水解能力檢測：Tp0751蛋白具有水解Fg的能力，在反應(yīng)持續(xù)24小時后Fg基本上被水解完全。（3）H198A突變型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測：H198A突變型Tp0751蛋白具有一定的水解Fg能力，在反應(yīng)持續(xù)24小時后Fg部分被水解。（4）H2