梅毒螺旋體兔感染模型構(gòu)建及臨床梅毒螺旋體菌株分離.pdf

1、目的：
　　本研究主要是建立梅毒螺旋體菌株接種到兔睪丸內(nèi)進行增殖、分離和傳代的實驗方法。以此方法分離梅毒螺旋體臨床菌株，并按arp、tpr基因分型系統(tǒng)對所分離的臨床菌株進行基因型的鑒定及對梅毒螺旋體阿奇霉素耐藥相關(guān)基因23SrRNA基因A2058G、A2059G突變位點檢測。
　　方法：
　　1.Nichols菌株接種、傳代:將凍存的梅毒螺旋體Nichols菌株復(fù)蘇后(0.5×107個/睪丸)接種于新西蘭兔的睪丸內(nèi)，動

2、態(tài)監(jiān)測兔血清TPPA、RPR滴度變化，觀察睪丸腫脹程度。在RPR快速上升及睪丸腫脹時，將兔處死分離，從睪丸分離梅毒螺旋體。分離得到的新鮮梅毒螺旋體Nichols菌株，按0.5×107個/睪丸進一步接種兔睪丸內(nèi);另一部分梅毒螺旋體凍存后，仍按0.5×107個/睪丸接種兔睪丸內(nèi)，同上述方法繼續(xù)檢測梅毒螺旋體在兔睪丸內(nèi)的擴增情況，建立梅毒螺旋體Nichols菌株在新西蘭兔睪丸內(nèi)的傳代方法;
　　2.梅毒螺旋體臨床菌株的分離、接種和傳代:

3、在2014年04月至12月期間，從上海市皮膚病醫(yī)院性病科我們獲得了10例早期梅毒患者可能含有梅毒螺旋體的標本（其中硬下疳來源2份、扁平濕疣來源6份、腦脊液來源1份、淋巴結(jié)來源1份）。將收集的新鮮皮損滲出物接種至新西蘭兔睪丸內(nèi)，按建立的梅毒螺旋體Nichols菌株接種傳代的方法保存及傳代臨床菌株。
　　3.梅毒螺旋體臨床菌株基因型鑒定:使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒抽提采集的臨床標本中的梅毒螺旋體DNA，以普通PC

4、R擴增arp基因，巣式PCR技術(shù)擴增tpr、23S rRNA基因。以MseI限制性內(nèi)切酶tpr基因擴增產(chǎn)物、以BsaⅠ及MboⅡ酶切23S rRNA基因擴增產(chǎn)物。結(jié)合PCR及酶切結(jié)果，分析各菌株arp、tpr的分子分型特征及對阿奇霉素的敏感性。
　　結(jié)果：
　　1.梅毒螺旋體Nichols菌株接種后，兔睪丸出現(xiàn)紅腫、脹大，局部大量炎癥細胞浸潤;復(fù)蘇梅毒螺旋體Nichols菌株接種平均5天兔血清TPPA轉(zhuǎn)陽，平均7天血清RPR

5、轉(zhuǎn)陽;直接傳代Nichols菌株接種平均6天兔血清TPPA轉(zhuǎn)陽，平均10.3天血清RPR轉(zhuǎn)陽。提示:Nichols菌株在兔睪丸內(nèi)能穩(wěn)定擴增和傳代。
　　2.我們成功分離了10株梅毒螺旋體臨床菌株，梅毒患者來源的標本接種到兔睪丸，20.9±11.5天出現(xiàn)兔血清TPPA陽性，29.3±11.9天兔血清RPR陽性，接種睪丸腫大，局部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。我們進一步將獲得臨床菌株進行傳代，6.4±4.5天出現(xiàn)兔血清TPPA陽性，13.8±5.5天

6、兔血清RPR陽性。提示:通過接種兔睪丸的方法能成功分離梅毒螺旋體臨床菌株并能穩(wěn)定傳代，但各株臨床菌株在兔體內(nèi)的擴增及反應(yīng)差異明顯。
　　3.我們依據(jù)arp、tpr基因分型系統(tǒng)成鑒定了5株梅毒螺旋體臨床菌株，其基因型均為14d;23SrRNA基因中都均A2058G點突變，而無A2059G點突變。
　　結(jié)論：
　　1.通過兔睪丸接種的方法，梅毒螺旋體Nichols菌株在兔睪丸內(nèi)能擴增、并能通過此方法進行傳代;
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