尖吻蝮蛇毒口服的抗栓作用研究.pdf

1、蛇毒的主要成分是生物活性多肽和蛋白質(zhì),約占干重的90％至95%。蛇毒屬于特殊中藥,主要成分為多肽或蛋白質(zhì),蛇毒制劑口服時能否吸收,活性組分吸收能否達到有效濃度水平,歷來都是學術(shù)爭論的焦點之一。因此,尖吻蝮蛇毒口服是否具有抗血栓作用及其機制如何,臨床用藥劑量應(yīng)為多少才合理等均不得而知。本課題擬觀察尖吻蝮蛇毒(agkistrodonacutusvenom,AAV)口服對動物實驗性血栓預防和治療作用及其機制,旨在為其進一步的研發(fā)提供實驗資料。

2、
　　1.小鼠口服AAV的急性毒性測定
　　成年健康昆明種小鼠,尖吻蝮蛇毒一次性灌胃,按Bliss法得出小鼠口服AAV的半數(shù)致死量LD50值為640±171mg·kg-1。根據(jù)小鼠LD50值,按照體表面積法推算出大鼠LD50近似值為301mg·kg-1。以LD50和預實驗的結(jié)果作為大鼠和小鼠口服AAV的劑量的依據(jù),將以40和80mg·kg-1(約為LD50的1/8-1/4)作為大鼠給藥劑量,以60和120mg·kg-1(約為

3、LD50的1/10-1/5)作為小鼠給藥劑量。
　　2.AAV口服對大鼠凝血功能的影響
　　手工法測定大鼠活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)和凝血酶時間(TT)。結(jié)果大鼠igAAV40和80mg·kg-1均能明顯延長APTT時間,AAV40和80mg·kg-1APTT分別為48.8±12.79s和42.0±8.40s,與生理鹽水組的23.6±6.11s比較有極顯著差別(p<0.01)和顯著差別(p<0.0

4、5)。PT分別為18.0±6.82s和12.4±1.34s,與生理鹽水組的12.2±3.27s比較無顯著性差別。TT分別為23.2±27.5s和22.6±22.4s,與生理鹽水組的15.4±14.2s比較無顯著性差別。由此可知,AAV在體內(nèi)通過抑制內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮抗凝作用。
　　3.AAV口服對ADP-Na2誘導的小鼠急性肺栓塞的影響
　　采用ADP-Na2誘導小鼠急性肺栓塞模型,由于ADP誘導血小板聚集形成微小血栓,血流

5、經(jīng)肺動脈時,造成肺動脈的微栓塞,出現(xiàn)呼吸窘迫癥,小鼠出現(xiàn)呼吸困難、翻正反射消失等癥狀,小鼠呼吸喘促的時間長短反映了栓塞的程度。AAV口服明顯縮短小鼠呼吸喘促的時間,AAV60和120mg·kg-1組其喘促時間分別為28.00±6.07s和37.38±6.09s,與模型組59.13±8.08s比較均有極顯著差別(p<0.01),AAV組與阿司匹林組的45.75±9.88s比較也有極顯著差別(p<0.01)和顯著差別(p<0.05),說明A

6、AV縮短小鼠呼吸喘促時間短于阿司匹林。與模型組比,HE染色給藥低高劑量組肺微血栓數(shù)均明顯減少。說明AAV可明顯縮短ADP誘導的血小板聚集性肺栓塞引起呼吸喘促的時間,同時使肺栓塞病灶內(nèi)的微血栓數(shù)減少,提示AAV在體內(nèi)對ADP-Na2誘導的血小板聚集具有抑制作用。
　　4.AAV口服對大鼠頸動靜脈(A—V)回路形成的血小板性血栓的影響
　　在大鼠頸動靜脈旁路循環(huán)中,當血流中的血小板接觸絲線粗糙面時,發(fā)生黏附、聚集效應(yīng),血小板聚集

7、物環(huán)繞絲線表面形成血栓。大鼠igAAV40和80mg·kg-1能明顯減輕血栓重量,AAV40和80mg·kg-1組血栓重量分別為31.98±1.04mg和27.48±0.77mg,阿司匹林組為28.13±2.76mg,與生理鹽水組52.61±2.07mg比較均有顯著差別(p<0.01)。說明AAV口服對血小板性動脈血栓的形成具有明顯抑制效應(yīng)。
　　5.AAV口服對凝血酶誘導的大鼠下腔靜脈血栓形成的影響
　　凝血酶能催化血液中

8、的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的纖維蛋白,誘導下腔靜脈后血栓形成。大鼠igAAV40和80mg·kg-1能明顯減輕凝血酶誘導的大鼠下腔靜脈血栓重量,AAV40和80mg·kg-1組血栓重量分別為55.08±2.56mg和35.53±2.52mg,蚓激酶組為34.36±4.22mg,與生理鹽水組72.53±3.09mg比較均有顯著差別(p<0.01)。說明AAV口服可預防大鼠下腔靜脈血栓的形成。
　　6.AAV口服對角叉菜膠誘導的小鼠尾部

9、混合血栓的影響
　　角叉菜膠能引起炎癥損傷血管內(nèi)皮細胞,激活外源性凝血系統(tǒng),造成尾部混合血栓的形成。小鼠igAAV60和120mg·kg-1組血栓形成率分別為75%和66%,阿司匹林組為60%,與生理鹽水組80%比較未見明顯差異。小鼠igAAV60和120mg·kg-1組尾部血栓形成相對長度分別為0.23±0.15cm和0.11±0.10cm,阿司匹林組為0.13±0.12cm,AAV120mg·kg-1組與生理鹽水組0.28±0

10、.15cm比較有顯著差別(p0.05)。說明AAV能明顯預防和治療小鼠尾部混合血栓且無明顯毒副作用。
　　7.AAV口服對血漿優(yōu)球蛋白溶解時間(euglobulinlysistime,ELT)影響
　　通過化學法測定大鼠血漿ELT,大鼠igAAV40和80mg·kg-1組能明顯縮短優(yōu)球蛋白凝塊溶解時間,口服40和80mg·kg-1組的ELT分別為342±34.2min和360

11、±56.1min,與生理鹽水組(>1440min)比較均有顯著差別(p<0.01)。說明AAV在體內(nèi)能激活纖溶系統(tǒng),發(fā)揮抗血栓作用。
　　8.AAV口服對組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)含量的影響
　　組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)與已形成血栓的纖維蛋白、纖溶酶原結(jié)合為三體復合物,誘導纖溶酶原成為纖溶酶,溶解血塊,發(fā)揮選擇性溶栓作用。采用Elisa法測定大鼠血漿中組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)的含量,大鼠igAAV40和

12、80mg·kg-1組血漿中t-PA含量明顯升高,分別為207.4±46.38pg·ml-1和375.6±97.92pg·ml-1,與生理鹽水組125.3±18.21pg·ml-1比較有顯著差別(P<0.05)和極顯著差別(P<0.01)。說明AAV能通過升高t-PA濃度激活纖溶酶原形成纖溶酶而提高纖溶系統(tǒng)活性。
　　9.大鼠尖吻蝮蛇毒含藥血清的體外纖溶活性測定
　　采用纖維蛋白平板法測定大鼠口服AAV含藥血清的纖溶活性。在加

13、熱纖維蛋白平板上,大鼠口服AAV40和80mg·kg-1含藥血清的溶解圈面積分別為14.76mm2和24.22mm2,均大于大鼠口服LK50mg·kg-1含藥血清的溶解圈面積12.87mm2,給藥組溶解圈面積均明顯大于生理鹽水組5.42mm2。在普通纖維蛋白平板上,大鼠口服AAV40和80mg?kg-1含藥血清的溶解圈面積分別為64.97mm2和98.81mm2,大鼠口服LK50mg?kg-1含藥血清的溶解圈面積為78.12mm2,給藥

14、組溶解圈面積均大于生理鹽水對照組溶解圈面積2.91mm2。
　　10.大鼠尖吻蝮蛇毒含藥血清對血塊溶解時間(BLT)的影響
　　大鼠口服AAV40和80mg·kg-1含藥血清對血塊的溶解率隨給藥劑量的增加而增大,血塊濕重明顯減小。AAV40和80mg·kg-1組溶解率分別為19.23±0.05和21.27±0.02,與生理鹽水組14.14±0.05比較有顯著差別(P<0.05)和極顯著差別(P<0.01)。說明AAV含藥血清