江浙短尾蝮蛇毒解離素的抗腫瘤血管生成作用研究.pdf

1、解離素(disintegrin)是一類富含半胱氨酸的小分子多肽，其含有精-甘-天冬氨酸(RGD)序列或賴-甘-天冬氨酸(KGD)序列能抑制依賴此識(shí)別位點(diǎn)的整合素與其配體結(jié)合，從而抑制血小板聚集形成瘤栓、腫瘤血管新生，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)、遷移的目的。本文擬從江浙短尾蝮(Gloydius brevicaudus，GBV)蛇毒中分離純化解離素GBV-Ⅳ4，并測(cè)定生物學(xué)活性，觀察其抑制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移作用。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、r>　　 1.江浙短尾蝮蛇毒解離素的分離純化
　　 根據(jù)福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒所分離純化江浙短尾蝮蛇毒解離素的方法應(yīng)用Superdex75凝膠過(guò)濾色譜、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜和Lichrospher C18反相色譜等技術(shù)從江浙短尾蝮蛇毒中分離純化解離素GBV-Ⅳ4。GBV-Ⅳ4在SDS-PAGE(Tris-Tricine系統(tǒng))凝膠電泳中，呈單一蛋白條帶。采用經(jīng)典的Born法，證明其能抑制ADP誘

3、導(dǎo)的血小板聚集。
　　 2.GBV-Ⅳ4對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)小管形成的影響
　　 采用小管形成實(shí)驗(yàn)觀察GBV-Ⅳ4對(duì)HUVEC的抗血管生成，發(fā)現(xiàn)GBV-Ⅳ4可劑量依賴地抑制HUVEC管腔形成。GBV-Ⅳ40.15、0.3和0.6mg/ml使小管形成數(shù)量分別由PBS組的35.667±6.062減少至15.556±4.925、9.556±3.046和2.222±1.563；小管形成面積分別由PBS組的2616.1

4、98±312.022(μm2)減少至1002.198±431(μm2)、421.621±52(μm2)和115.926±102.01(μm2)；小管形成周長(zhǎng)分別由PBS組的965.431143.991(μm)減少至435.059±168.221(μm)、180.944±68.178(μm)和71.25±61.26(μm)。
　　 3.GBV-Ⅳ4對(duì)b-FGF誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠血管生成的影響
　　 小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠血管生成

5、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GBV-Ⅳ4對(duì)血管生成的影響。組織切片免疫組化染色后計(jì)數(shù)b-FGF陽(yáng)性對(duì)照、b-FGF+GBV-Ⅳ41.25mg/kg、b-FGF+GBV-Ⅳ42.5mg/kg和PBS陰性對(duì)照各組基質(zhì)膠內(nèi)微血管數(shù)。GBV-Ⅳ4可劑量依賴地抑制基質(zhì)膠內(nèi)微血管的形成，b-FGF組微血管數(shù)為17.13±3.20，b-FGF+GBV-Ⅳ41.25mg/kg、b-FGF+GBV-Ⅳ42.5mg/kg組分別為9.80±1.95和2.33±0.75，PBS細(xì)

6、為0.4±0.44。
　　 4.GBV-Ⅳ4對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F1實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移的影響
　　 實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GBV-Ⅳ4對(duì)B16F1體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。GBV-Ⅳ41.25mg/kg和2.5mg/kg能顯著減少轉(zhuǎn)移瘤數(shù)，PBS、GBV-Ⅳ41.25mg/kg和2.5mg/kg作用下小鼠肺結(jié)節(jié)數(shù)分別為181.14±61.00、118.75±17.44和73.87±34.21。免疫組化染色顯示GBV-Ⅳ41.25mg/

7、kg和2.5mg/kg能顯著減少腫瘤組織內(nèi)血管的新生，PBS、GBV-Ⅳ41.25mg/kg和2.5mg/kg作用下腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)微血管數(shù)分別為28.40±2.70、24.4±3.36和11.4±5.77。
　　 結(jié)論：用Superdex75凝膠過(guò)濾色譜、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜和Lichrospher C18反相色譜從短尾蝮蛇毒粗毒中分離解離素是穩(wěn)定、可行的技術(shù)路線。GBV-Ⅳ4能抑制ADP誘導(dǎo)