江浙短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑的藥代動力學過程.pdf

1、蛇毒中含有較多的影響血液系統(tǒng)功能的活性組分，如：凝血酶樣酶、解離素、纖溶酶、纖溶酶原激活劑、凝血X因子激活劑等，特別是在蝮科和蝰科蛇毒中尤為突出。 1993年，中科院昆明動物研究所的張云等[1]首先報道從竹葉青蛇(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒中分離純化出具有激活纖溶酶原作用的蛋白酶(TSV-PA)，以及對TSV-PA的大量后續(xù)研究，為新型溶栓藥物的開發(fā)提供了新的思路。本實驗室已成功從江浙短尾蝮(Gloyd

2、ius brevicaudus)蛇毒中分離純化出短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑(plasminogen activator of Gloydius brevicaudusvenom，GBV-PA)，并通過動物實驗證實它對動物實驗性血栓具有治療和預防作用。為了全面了解GBV-PA的藥理學特點，本課題擬研究在動物體內(nèi)的藥物代謝動力學，為進一步的開發(fā)研究提供初步的藥代動力學數(shù)據(jù)。 1.GBV-PA的分離純化及部分理化性質(zhì)測定 [1]

3、GBV-PA的分離純化 短尾蝮粗蛇毒用苯甲脒-瓊脂糖凝膠(Benzamidine Sepharose6B)親和層析，得到兩個蛋白峰，收集具有酶活性的第二峰，經(jīng)濃縮后再用Superdex G-75凝膠過濾層析進一步純化，得到3個蛋白峰，經(jīng)纖維蛋白平板法鑒定第II峰的降支具有激活纖溶酶原，間接溶解纖維蛋白的作用，該組分再過Lichrospher C184.6/250反相色譜柱，得到純品GBV-PA。 [2] GBV-PA的理

4、化性質(zhì) GBV-PA經(jīng)十二烷基硫酸鈉.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。在β-巰基乙醇還原和非還原條件下，均顯示單一條帶，即其為單一肽鏈的蛋白質(zhì)，分子量為40kDa左右。 2.GBV-PA抗體的分離純化及部分理化性質(zhì)測定 [1] GBV-PA抗體的分離純化 應用已活化的CNBr-activated Sepharose4B瓊脂糖凝膠與GBV-PA反應，將GBV-PA偶聯(lián)在瓊脂糖凝膠的活化臂上，再用親

5、和層析的原理，用自制的瓊脂糖凝膠分離純化蝮蛇毒抗血清，得到兩個蛋白峰并收集第二個蛋白峰。 [2]GBV-PA抗體的理化性質(zhì) GBV-PA抗體與短尾蝮粗蛇毒經(jīng)苯甲脒-瓊脂糖親和層析后的第二峰和純品經(jīng)雙向免疫擴散活后，可見清晰的免疫沉淀線，且各沉淀線之間互相融合。 3.抑制性BA-ELISA測定GBV-PA血藥濃度 3.1抑制性BA-ELISA檢測方法 采用96孔酶標板，每孔加入含有GBV-PA的包被

6、緩沖液100μl包板，4℃過夜，用洗滌緩沖液(PBST)洗滌三次，每次3min后，加入封閉緩沖液含100μl/孔，37℃封閉120min，PBST洗滌。同時經(jīng)適當稀釋后的待測樣品與定量抗體置37℃，孵育120min后，每孔加入反應后的樣品，100μl/孔，37℃溫育120min，PBST洗滌。再加入生物素標記的二抗，37℃孵育120min，PBST洗滌，加入HRP標記的親和素，37℃反應40min后，加入鄰苯二胺(OPD)底物100μl

7、/孔顯色，37℃，30min后立即加入2mol/L硫酸50μl終止反應，于30min內(nèi)用MultiskanMK3型酶標儀測定A492mm值。 3.2最適包被抗原濃度 固定GBV-PA抗體、二抗及親和素-HRP的濃度，用包被緩沖液配成系列稀釋的抗原溶液，按上述流程進行ELISA測定。以含GBV-PA抗體而不含GBV-PA的Beagle犬血漿的A492nm值為1.5，不合GBV-PA抗體也不含GBV-PA血漿的A492nm值

8、最小時的包被抗原濃度為最佳包被濃度，則最佳包被抗原濃度為0.5μg/ml。 3.3最適GBV-PA抗體濃度 固定GBV-PA、二抗和親和素-HRP的濃度，用稀釋緩沖液配成系列稀釋的GBV-PA抗體溶液，操作同上。以含GBV-PA抗體而不含GBV-PA的Beagle犬血漿的A492nm值為1.5，不含GBV-PA抗體也不含GBV-PA血漿的A492nm值最小時的包被抗原濃度為最佳包被濃度，則最佳抗體濃度為0.6×10-3U

9、/ml 3.4標準曲線的建立及靈敏度檢測 用20倍稀釋后的空白Beagle犬血漿系列稀釋GBV-PA，在包被抗原濃度為0.5μg/ml，抗體濃度為0.6×10-3U/ml的條件下進行ELISA測定，所得△A492nm值與GBV-PA的對數(shù)劑量進行直線回歸，在抗原為1ng/m1～32ng/ml的線性范圍內(nèi)，標準曲線為：y=0.3173x+0.3491，r=0.9927。檢測水平達到1ng/ml。 4.血樣、膽汁和尿

10、液的采集 4.1 Beagle犬血樣的收集和檢測 Beagle犬36只，雌雄兼用，分為單次靜脈給藥組和動脈局部給藥組，前者分別靜注GBV-PA75和300μg/kg，后者分別大腦中動脈內(nèi)注射GBV-PA18.75、37.5和75μg/kg，每一劑量組6只。Beagle犬靜脈注射戊巴比妥鈉30μg/kg麻醉，靜注肝素3125U/kg體內(nèi)抗凝。靜脈給藥組在耳緣靜脈給藥，在股動脈插管處取血，在給藥后立即計時，按不同時間點采集

11、血液標本。局部給藥組為大腦中動脈給藥，通過介入術，在股動脈插管，并在股動脈插管處取血，給藥時間為10min，給藥后立即計時，按不同時間點采集血液標本，低溫離心(3000rpm)10min，取上清液用PBS作適當稀釋。 Beagle犬靜脈注射GBV-PA300μg/kg和75μg/kg的體內(nèi)過程符合二室開放模型，t1/2α分別為3min和7min，t1/2β分別為5861min和5107min。表觀分布容積分別為0.25L/kg

12、和0.3L/kg。其藥-時分別為C(t)=1815e-0.2181t+107e-0.0046t和C(t)=4897e-0.1862t+39e-0.0056t。動脈局部推注75μg/kg、37.5μg/k和18.75μg/kg后，Cmax分別為6472ng/ml、1413ng/ml和1442ng/ml，tpeak為15min。 4.2大鼠膽汁尿液的收集和檢測 大鼠6只，雌雄兼用，靜脈注射烏拉坦0.16mg/kg麻醉，仰臥位

13、固定于大鼠手術臺上，給藥前，在左股靜脈處留置插管，持續(xù)靜脈滴注生理鹽水30ml/kg·h-1，膽總管插管，膀胱插管引流膽汁和尿液。右股靜脈注射GBV-PA300μg/kg后，分段收集膽汁和尿液。收集尿液時，每段時間間隔收集尿液前用手擠壓膀胱使其排空以盡量減少死腔，每段收集10min。取上清液用PBS做適當稀釋，測得GBV-PA主要經(jīng)腎臟排泄，1h從尿中排出的GBV-PA相同抗原性物質(zhì)的量為7.06％，4h的排出量為12，78％。經(jīng)膽汁排