組織型纖溶酶原激活劑（tPA）在坐骨神經(jīng)損傷與恢復(fù)過(guò)程中的作用研究.pdf

1、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是絲氨酸蛋白酶家族的一員，其主要的生物學(xué)功能是激活纖溶酶原(Plasminogen，Plg)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(Plasmin)，后者可以降解血栓中的纖維蛋白，用于治療急性心肌梗塞等血栓性疾病。近年來(lái)的研究表明，除了參與循環(huán)系統(tǒng)的溶血栓過(guò)程之外，tPA在神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮了重要的作用，參與了癲癇和早老型癡呆癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展，在學(xué)習(xí)和記憶等生理過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用；在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，tPA的活性在坐骨神

2、經(jīng)損傷后迅速增高，tPA基因缺失明顯延遲了小鼠坐骨神經(jīng)損傷的恢復(fù)，說(shuō)明tPA在外周神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與恢復(fù)過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用。 為了解tPA在小鼠坐骨神經(jīng)損傷和恢復(fù)過(guò)程中的作用，我們研究了tPA及其它同坐骨神經(jīng)損傷和恢復(fù)相關(guān)分子在坐骨神經(jīng)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的變化，分析這種變化與小鼠坐骨神經(jīng)損傷和損傷后再生之間的關(guān)系。我們建立小鼠坐骨神經(jīng)鉗夾傷的動(dòng)物模型，通過(guò)形態(tài)和功能學(xué)的方法檢測(cè)了小鼠坐骨神經(jīng)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的

3、情況。同時(shí)采用酶譜分析法檢測(cè)了tPA活性在坐骨神經(jīng)損傷后各階段的變化，并分析這種變化與纖維蛋白沉積、髓鞘碎片沉積等影響神經(jīng)再生的因素之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，從損傷后第8天開(kāi)始，小鼠坐骨神經(jīng)功能開(kāi)始逐漸恢復(fù)，新生軸突和有髓軸突的數(shù)目也逐漸增多，沉積的纖維蛋白和髓鞘碎片逐漸被清除，tPA活性在損傷后第2天達(dá)到高峰，并持續(xù)至第8天，提示tPA參與清除沉積的纖維蛋白和髓鞘碎片，為神經(jīng)再生提供了良好的微環(huán)境，外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷是常見(jiàn)的外科損傷，現(xiàn)在還

4、缺乏很好的治療手段。為了研究外源性tPA是否具有促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的作用，我們建立小鼠坐骨神經(jīng)鉗夾傷動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組，損傷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，在鉗夾坐骨神經(jīng)后第7天，分別將吸附有100ul(1ug／u1)tPA、Plg、tPA與Pig混合物(tPA／Plg)的明膠海綿包裹在左側(cè)損傷的神經(jīng)周圍，右側(cè)包裹吸附等體積PBS的明膠海綿作為對(duì)照，給藥處理7天后處死動(dòng)物。甲苯氨蘭染色結(jié)果表明，外源性的tPA或tPA／Plg可以

5、明顯促進(jìn)損傷后軸突和髓鞘的再生，tPA或tPA／Plg處理后的坐骨神經(jīng)組織中有髓軸突和總的軸突數(shù)目明顯高于對(duì)照組，單獨(dú)給予Pig則沒(méi)有影響。免疫熒光結(jié)果表明，外源性tPA或tPA／Plg也可以促進(jìn)神經(jīng)絲蛋白(NF)的表達(dá)，這同軸突再生的結(jié)果是一致的，同時(shí)tPA或tPA／Plg處理可以減少神經(jīng)組織內(nèi)的纖維蛋白沉積。此外，外源性tPA或tPA／Plg處理明顯增加了神經(jīng)組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，而這些巨噬細(xì)胞都是表達(dá)MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞，MMP-

6、9水平贈(zèng)高和巨噬細(xì)胞數(shù)量增多可以進(jìn)一步降解神經(jīng)組織中沉積的膠原纖維和變性髓鞘碎片。分析腓腸肌肌肉萎縮系數(shù)說(shuō)明外源性tPA或tPA／Plg可以促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。這些結(jié)果說(shuō)明外源性tPA或tPA／Plg通過(guò)降解沉積的纖維蛋白以及促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)清除沉積的髓鞘碎片和膠原纖維，促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。tPA是美國(guó)FDA認(rèn)證的唯一用于治療急性腦梗塞的溶栓類藥物，tPA用于治療外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷也將有令人鼓舞的前景。 坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生

7、能力很大程度上取決于新生軸突的穿越能力，為了穿過(guò)由細(xì)胞碎片和變性的細(xì)胞外基質(zhì)組成的瘢痕組織，多種蛋白酶參與了新生軸突的生長(zhǎng)，tPA和MMP-9是其中非常重要的兩種蛋白酶。越來(lái)越多的研究表明，tPA參與調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)和活化，tPA基因缺失下調(diào)了坐骨神經(jīng)損傷后MMP-9的活性，tPA基因缺失小鼠腎臟中MMP-9表達(dá)量較野生型小鼠明顯減少，在體外實(shí)驗(yàn)中外源性tPA則可以促進(jìn)了腎臟成纖維上皮細(xì)胞表達(dá)MMP-9。為了進(jìn)一步闡明tPA對(duì)坐骨神

8、經(jīng)損傷后MMP-9表達(dá)的影響，我們利用tPA基因缺失小鼠作為研究對(duì)象，建立小鼠坐骨神經(jīng)損傷動(dòng)物模型，對(duì)照組采用野生型小鼠。結(jié)果表明，tPA基因缺失明顯下調(diào)了神經(jīng)損傷后神經(jīng)組織中MMP-9的表達(dá)。野生型小鼠在神經(jīng)損傷后第2天神經(jīng)組織內(nèi)出現(xiàn)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞數(shù)量在損傷后第8天達(dá)到高峰，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞正是表達(dá)MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞，tPA基因的缺失則明顯抑制了巨噬細(xì)胞向神經(jīng)組織中的浸潤(rùn)。這些結(jié)果提示tPA基因缺失降低了巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，