短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑對(duì)動(dòng)物凝血、循環(huán)、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響.pdf

1、蛇毒中含有較多的影響血液系統(tǒng)功能的活性組分，如：凝血酶樣酶、解離素、纖溶酶、纖溶酶原激活劑、凝血X因子激活劑等，特別是在蝮科和蝰科蛇毒中尤為突出。
　　 1993年，中科院昆明動(dòng)物研究所的張?jiān)频萚1]首先報(bào)道從竹葉青蛇(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒中分離純化出具有激活纖溶酶原作用的蛋白酶(TSV-PA)，并對(duì)TSV-PA的大量后續(xù)研究，為新型溶栓藥物的開發(fā)提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)室已成功從江浙短尾蝮(Glo

2、ydius brevicaudus)蛇毒中分離純化出短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑(plasminogen activator of Gloydius brevicaudusvenom，GBV-PA)，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性血栓具有治療和預(yù)防作用。為了全面了解GBV-PA的藥理學(xué)特點(diǎn)，本課題擬研究GBV-PA對(duì)動(dòng)物凝血系統(tǒng)的影響和并觀察其一般藥理學(xué)作用，為進(jìn)一步的開發(fā)研究提供資料。
　　 1.GBV-PA的分離純化及部分理化

3、性質(zhì)測(cè)定
　　 1.1 GBV-PA的分離純化
　　 短尾蝮蛇粗蛇毒用苯甲脒-瓊脂糖凝膠(Benzamide SepharoseTM4 Fast Flow)親和層析，得到兩個(gè)蛋白峰，收集具有酶活性的第二峰，經(jīng)濃縮后再用Superdex G-30凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化，得到2個(gè)蛋白峰，纖維蛋白平板法鑒定第Ⅱ峰的降支具有激活纖溶酶原，間接溶解纖維蛋白的作用，該組分再過(guò)Lichrospher C184.6/250反相色譜柱，得

4、到2個(gè)蛋白峰，經(jīng)纖維蛋白平板法鑒定得到第Ⅱ峰具有間接溶解纖維蛋白作用，既GBV-PA。
　　 1.2 GBV-PA的理化性質(zhì)
　　 GBV-PA經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，在β-巰基乙醇還原和非還原條件下，均顯示單一條帶，即其為單一肽鏈的蛋白質(zhì)，分子量為40kDa左右。
　　 1.3 GBV-PA對(duì)小鼠的急性毒性
　　 按照化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則測(cè)定GBV-PA對(duì)小

5、鼠的急性毒性。做了一個(gè)初始劑量360μg.kg-1小鼠預(yù)試驗(yàn)，觀察期內(nèi)小鼠不出現(xiàn)急性毒性，以2倍的倍數(shù)遞增劑量，128倍劑量時(shí)小鼠仍不出現(xiàn)急性毒性。給予小鼠最大給藥濃度、最大給藥體積劑量，進(jìn)行最大耐受量(Maximal tolerance dose，MTD)實(shí)驗(yàn)，小鼠未見(jiàn)其他異常反應(yīng)。表明GBV-PA靜脈注射給藥不能獲得對(duì)小鼠的LD50，單次給藥也無(wú)明顯毒性反應(yīng)。
　　 2.GBV-PA對(duì)家兔凝血功能的影響
　　 取健康

6、家兔30只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組即：GBV-PA75μg.kg-1、150μg.kg-1、300μg.kg-1、生理鹽水陰性對(duì)照組和UK陽(yáng)性對(duì)照組。分別于用藥前，用藥后60min取血2ml，以3.8％枸櫞酸鈉(9：1)抗凝。制備貧血小板血漿(PPP)，測(cè)定兔血漿的PT、APTT、TT及凝血時(shí)間CT。結(jié)果家兔靜脈注射不同劑量的GBV-PA后，家兔的凝血時(shí)間CT從原來(lái)的108s左右延長(zhǎng)到120s～158s，家兔的APTT從原來(lái)的40s左右

7、延長(zhǎng)到68s～153s，家兔的PT從原來(lái)的16s左右延長(zhǎng)到48s～93s，TT則從原來(lái)的20s左右延長(zhǎng)到98s～150s，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　 3.GBV-PA對(duì)動(dòng)物循環(huán)、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響
　　 3.1 GBV-PA對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響
　　 觀察GBV-PA對(duì)小鼠自主行為活動(dòng)、自發(fā)活動(dòng)、協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)和閥下戊巴比妥鈉催眠實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果小鼠靜脈注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1

8、后，與NS組比較，小鼠自主行為活動(dòng)基本正常；與NS組比較，GBV-PA對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)影響無(wú)顯著性差異(p＞0.05)；與NS對(duì)照組和氯丙嗪陽(yáng)性對(duì)照組比較，GBV-PA對(duì)小鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)無(wú)影響；與安定陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，GBV-PA對(duì)各劑量組小鼠閾下劑量戊巴比妥鈉催眠亦無(wú)協(xié)同作用；表明靜脈注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1對(duì)小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)和精神系統(tǒng)均無(wú)明顯影響。
　　 3.2 GBV-PA對(duì)大鼠血壓和心率

9、的影響
　　 采用多導(dǎo)生物信號(hào)記錄儀觀察記錄麻醉大鼠給藥前后收縮壓(SAP)、舒張壓(DAP)、心率(HR)的變化。結(jié)果與NS對(duì)照組相比，靜脈注射GBV-PA90、360、720μg.kg-1后大鼠的SAP、DAP、MAP和HR變化無(wú)顯著性差異。
　　 3.3 GBV-PA對(duì)麻醉大鼠呼吸功能的影響
　　 將張力傳感器用手術(shù)線連接并固定于動(dòng)物劍突皮膚處，信號(hào)連接于多導(dǎo)生物信號(hào)記錄儀，測(cè)定麻醉大鼠給藥前后的呼吸頻率和

10、呼吸幅度，同時(shí)用Ⅱ?qū)?lián)心電電極測(cè)定大鼠的心電圖。結(jié)果與NS對(duì)照組相比，靜脈注射GBV-PA75、150和300μg.kg-1對(duì)大鼠呼吸頻率和呼吸幅度和心電圖無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：小鼠靜脈注射GBV-PA46mg/kg未見(jiàn)明顯毒性；家兔iv GBV-PA75、150和300μg.kg-1血漿的PT、APTT、TT、CT顯著延長(zhǎng)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；靜脈注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1對(duì)小鼠的自發(fā)活動(dòng)、自主行