尖吻蝮蛇毒糖苷水解酶的活性鑒定及影響因素分析和金屬離子及配合物與Intein的結(jié)合和抑制作用.pdf

1、本論文從生物無機(jī)化學(xué)角度對兩種重要的酶——尖吻蝮蛇蛇毒糖苷水解酶（AA-NADase）和肺結(jié)核分枝桿菌RecA intein進(jìn)行了性質(zhì)和功能的研究。在已報道的糖苷水解酶中，只有AA-NADase含有Cu2+和鏈間二硫鍵。在綜合分析AA-NADase的多功能活性中，首次發(fā)現(xiàn)該酶具有ATP/ADPase-like的新活性：進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，AA-NADase的多功能活性依賴于Cu2+離子和二硫鍵。AA-NADase可能利用同一活性位點(diǎn)水解兩種

2、不同類型的化學(xué)鍵。Intein自催化的蛋白剪接作用受到金屬離子的抑制，采用金屬離子與蛋白相互作用的多種實(shí)驗(yàn)方法我們研究了七種金屬離子與intein的結(jié)合作用，并對其抑制作用進(jìn)行了分析；初步的金屬配合物抑制蛋白剪接作用的體內(nèi)體外篩選，為金屬配合物類藥物成為潛在的抗結(jié)核新藥提供了可能。主要內(nèi)容歸納如下：
　　 第一章是對糖苷水解酶和生物無機(jī)化學(xué)常用實(shí)驗(yàn)手段的文獻(xiàn)綜述。第一小節(jié)重點(diǎn)介紹了ADP ribosyl環(huán)化酶家族三大成員Aply

3、sia ADP ribosyl環(huán)化酶、人CD38、人CD157的催化活性、結(jié)構(gòu)、保守序列以及它們的廣泛應(yīng)用。還介紹了來源于豬腦的首個具有類磷酸酯酶活性的糖苷水解酶（sNADase）以及來源于蛇毒的糖苷水解酶的研究概況。第二小節(jié)概括總結(jié)了多種常用于分析金屬離子與蛋白相互作用的實(shí)驗(yàn)方法，包括紫外光譜、色氨酸熒光淬滅、核磁共振、質(zhì)譜、等溫滴定量熱、平衡透析、原子吸收、圓二色譜、動態(tài)光散射、擴(kuò)展X-ray吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)、電子順磁共振。
　　

4、 第二章用陰離子交換色譜和分子篩凝膠色譜分離純化AA-NADase，利用高效液相色譜法分析了AA-NADase對NAD的水解作用以及對NGD的環(huán)化和水解雙重作用，并測定了這兩種底物的酶催化動力學(xué)參數(shù)。發(fā)現(xiàn)腺營衍生物ATP、ADP、AMP是NAD水解活性的競爭性抑制劑，測定了相應(yīng)的抑制常數(shù)。首次發(fā)現(xiàn)AA-NADase可以水解ATP、ADP中的P-O-P鍵生成AMP，但不能水解NAD和NGD中的P-O-P，這種水解又不同于ATPase，因

5、為AA-NADase也水解ATPase的非酶水解底物AMPPNP，我們稱這種新功能為ATP/ADPase-like的活性。進(jìn)一步測定了AA-NADase水解ATP、ADP、AMPPNP的酶催化動力學(xué)參數(shù)。等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AMP可以高親性結(jié)合AA-NADase，但AMP不能被AA-NADase水解。
　　 第三章分析了Cu2+和二硫鍵對AA-NADase的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和多功能活性的影響。AA-NADase的活性依賴于Cu2

6、+。AA-NADase中存在兩類Cu2+結(jié)合位點(diǎn)：一個起激活作用的高親和性特異性結(jié)合位點(diǎn)（Kd=10-12M）和多個起抑制作用的低親和性結(jié)合位點(diǎn)（Kd=10-9M）。高親和性位點(diǎn)上Cu2+是AA-NADase多種催化活性所必須的，但低親和性位點(diǎn)上Cu2+抑制AA-NADase的活性。銅離子的價態(tài)與AA-NADase活性相關(guān)，AA-NADase的多功能催化活性依賴于Cu2+，Cu+不結(jié)合apo-AA-NADase，也不能恢復(fù)apo-AA-

7、NADase的活性。Cu2+離子對維持蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有非常重要的作用。Zn2+或Mn2+重組AA-NADase具有比Cu2+-AA-NADase更強(qiáng)的多功能催化活性；Co2+重組AA-NADase活性與Cu2+-AA-NADase活性相當(dāng)；但Ni2+能抑制AA-NADase活性。AA-NADase的活性依賴于二硫鍵，二硫鍵還原劑通過破壞二硫鍵和還原蛋白中Cu2+抑制AA-NADase的活性。鹽酸胍變性和熱變性實(shí)驗(yàn)結(jié)果都說明Cu2+和

8、二硫鍵對于維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要的作用。AA-NADase特有的Cu2+和二硫鍵結(jié)構(gòu)是其具有獨(dú)特的多功能活性的內(nèi)在原因。
　　 第四章對蛋白剪接作用及蛋白內(nèi)含子（intein）做了文獻(xiàn)概述。分別介紹了蛋白剪切作用、intein的命名、分布、保守基序、結(jié)構(gòu)域、種類、鑒定、生物學(xué)功能、三維結(jié)構(gòu)特征、應(yīng)用及蛋白剪接反應(yīng)機(jī)理。分析了近些年來關(guān)于intein研究的狀況和進(jìn)展，為我們課題的開展做了基礎(chǔ)鋪墊，指導(dǎo)了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　

9、 第五章綜合利用金屬離子與蛋白結(jié)合的常用方法，研究了Zn2+、Cd2+、Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Cu+離子與△△Ihh-CM、△△Ihh-SM和△I-SM的相互作用，給出了相應(yīng)的結(jié)合比例，結(jié)合親和力和結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金屬離子與蛋白剪接活性中心關(guān)鍵殘基的配位作用，是導(dǎo)致金屬離子抑制蛋白剪接作用的原因。金屬離子結(jié)合蛋白能力各不相同，親和力范圍從10-7M到10-11M，但是金屬離子與蛋白結(jié)合的親和力強(qiáng)弱順序與金屬離子對蛋白

10、剪接的抑制效率是一致的。這部分研究為設(shè)計合成intein抑制劑提供了理論依據(jù)。
　　 第六章是對23種金屬配合物對蛋白剪接抑制作用的初步篩選。通過一系列的體內(nèi)、體外檢測實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)金屬鉑類配合物具有很好的蛋白剪接抑制作用。就配合物P-0810而言，其體外活性分析的抑制IC50值為2.5μM；在TS體內(nèi)報告體系中其良好的抑制效果表現(xiàn)為IC50值為7.71μM，同時在ALSII體內(nèi)報告體系中的IC50值為18.47μM；無論是在結(jié)核

11、菌H37Ra的固體還是液體培養(yǎng)中配合物P-0810都表現(xiàn)除了明顯的抑制作用，其抑制生長的IC50值為10μM，MIC值小于40μM，處在常用臨床抗菌藥的相同濃度水平。鉑類配合物對intein的抑制作用效果明顯受到配合物結(jié)構(gòu)的影響，順式>單齒>>反式。初步的抑制機(jī)理探討發(fā)現(xiàn)配合物P-0810和intein結(jié)合在溶液體系中產(chǎn)物并不單一，質(zhì)譜分析顯示至少存在兩種加合物，NMR分析發(fā)現(xiàn)鉑與intein活性中心關(guān)鍵殘基（Cysl、His73等）的