尖吻蝮蛇毒金屬蛋白酶AaHIV及其結(jié)構(gòu)域免疫效果評價.pdf

1、一、研究背景:
　　抗蛇毒血清是世界衛(wèi)生組織推薦的治療毒蛇咬傷的唯一特效藥物。從世界范圍內(nèi)看,目前抗蛇毒血清仍然是通過免疫馬或羊等動物來獲得。然而,蛇毒是一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)、多肽混合物,其中部分具有很強抗原性的毒素,卻沒有或只有很弱的免疫原性;部分具有很強免疫原性的毒素,卻沒有或只有很弱的抗原性。毒素抗原性和免疫原性的分離,使得目前使用全蛇毒免疫制備的抗蛇毒血清中還存在沒有保護(hù)性效價的免疫球蛋白,進(jìn)一步加重了異源動物蛋白造成了過敏性

2、休克、血清病等嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生。
　　理想的免疫原應(yīng)該是僅僅包含能夠刺激動物產(chǎn)生有效保護(hù)性抗體的致病毒素。
　　尖吻蝮蛇是一種廣泛分布于我國南方地區(qū)的蝰科類毒蛇。其毒性強,毒液量大,受傷患者病情進(jìn)展快、并發(fā)癥多、預(yù)后差,往往面臨截肢或死亡的威脅,是臨床治療中的一大難題。蛇毒金屬蛋白酶(snake venom metalloproteinases SVMPs)目前被認(rèn)為是尖吻蝮蛇等蝰科類毒蛇毒液中含量最豐富、出血活性最強的致

3、病毒素。AaHⅣ是來源于尖吻蝮蛇毒的出血性P-Ⅲ型 SVMPs,具有完整的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域(催化結(jié)構(gòu)域)、類去整合素結(jié)構(gòu)域和富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(非催化結(jié)構(gòu)域),具有明顯的出血活性和抑制血小板聚集活性。
　　二、目的和方法:
　　為了減少免疫毒素的種類、優(yōu)化免疫原結(jié)構(gòu)、減少不良反應(yīng)發(fā)生率,我們:
　　1)使用親和層析和疏水層析等方法,從尖吻蝮蛇粗毒中純化出天然出血性 P-Ⅲ型 SVMPs AaHⅣ,并將其作為免疫原,同佐

4、劑一起皮下注射免疫小鼠,3輪免疫后通過間接ELISA法檢測抗體效價,確定其是否具有免疫原性;同時,比較使用AaHⅣ免疫小鼠與全蛇毒免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清對全蛇毒攻毒的小鼠保護(hù)性差異;
　　2)在前部分實驗的基礎(chǔ)上,采用基因工程技術(shù)分別合成AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域cDNA,并分別重組在pET28a(+)質(zhì)粒上表,通過工程菌E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá);表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA親和層析法進(jìn)行純化,并分別使用AaHⅣ

5、、催化結(jié)構(gòu)域片段、非催化結(jié)構(gòu)域片段、PBS免疫小鼠,3輪免疫后通過間接 ELLISA法檢測其是否具有免疫原型;同時,比較使用AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段、非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫小鼠與使用AaHⅣ免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清對AaHⅣ攻毒的小鼠保護(hù)性差異。
　　三、結(jié)果:
　　1、天然AaHⅣ蛋白純化
　　經(jīng)過離子親和層析和疏水層析,以及脫鹽等步驟,成功從江西產(chǎn)尖吻蝮蛇粗毒中純化到出血性P-Ⅲ型SVMP AaHⅣ蛋白,皮下注射昆明小鼠證

6、明其具有出血活性,并通過BLISS法測定其LD50為10.07μg/g。
　　2、AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域表達(dá)及純化
　　根據(jù)Genebank中查詢到的AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域mRNA序列,進(jìn)行密碼子最優(yōu)化后,通過基因合成的方法分別獲得 AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域和非催化結(jié)構(gòu)域cDNA,并重組在pET28a(+)表達(dá)質(zhì)粒上。經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)入工程菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)分別表達(dá)出AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段和

7、非催化結(jié)構(gòu)域片段。AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段表達(dá)形式為包涵體,經(jīng)8mol/L尿素溶液溶解,采用His標(biāo)簽純化,脫鹽后得到AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段;AaHⅣ非催化結(jié)構(gòu)域片段表達(dá)形式為可溶蛋白,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA親和層析法純化,脫鹽后得到AaHⅣ非催化結(jié)構(gòu)域片段。
　　3、抗體效價:
　　分別使用同批次江西產(chǎn)尖吻蝮蛇毒、AaHⅣ蛋白、AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段、AaHⅣ非催化結(jié)構(gòu)域片段、PBS,對昆明小鼠進(jìn)行腹股溝皮下免疫,首輪免

8、疫使用完全弗氏佐劑,后兩輪免疫使用不完全弗氏佐劑。3輪免疫后1周通過尾靜脈采血,間接ELISA法提示尖吻蝮蛇毒免疫組、AaHⅣ免疫組、AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組、AaHⅣ非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組小鼠均能產(chǎn)生高效價IgG抗體。
　　4、出血抑制實驗:
　　小鼠3輪免疫后摘眼球取血,分離血清,將尖吻蝮蛇毒免疫組、AaHⅣ免疫組和PBS免疫組抗血清分別與尖吻蝮蛇毒混合(5μl:1μg),37℃孵育1小時后注射未免疫小鼠背部皮膚皮下

9、。24小時后測量小鼠皮下出血面積(n=6):AaHIV免疫組為(44.83±19.48)mm2,尖吻蝮蛇毒免疫組為(1.50±3.67)mm2,PBS組為(134.83±21.97) mm2。經(jīng)one way-ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,AaHⅣ免疫組和尖吻蝮蛇毒免疫組皮下出血面積之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001),而AaHⅣ免疫組與PBS組之間皮下出血面積也有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.001)。
　　小鼠3輪免疫后摘眼球取血,分離血

10、清,將AaHⅣ免疫組、催化結(jié)構(gòu)域免疫組、非催化結(jié)構(gòu)域免疫組和PBS免疫組抗血清分別與新鮮純化的AaHⅣ混合(5μl:1μg),37℃孵育1小時后注射未免疫小鼠背部皮膚皮下。24小時后測量小鼠皮下出血面積(n=6):AaHⅣ免疫組為(2.83±4.92)mm2,催化結(jié)構(gòu)域免疫組為(5.67±6.74)mm2,非催化結(jié)構(gòu)域免疫組為(16.50±11.04)mm2,PBS組為(52.50±16.94)mm2。經(jīng) one way-ANOVA統(tǒng)計

11、學(xué)分析,AaHⅣ免疫組、催化結(jié)構(gòu)域免疫組、非催化結(jié)構(gòu)域免疫組均較 PBS組顯著減少出血面積(P<0.001);AaHⅣ免疫組與催化結(jié)構(gòu)域免疫組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),而與非催化結(jié)構(gòu)域免疫組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);
　　5、攻毒實驗:
　　新鮮配置的尖吻蝮蛇毒溶液2LD50劑量采用腹腔注射的方法對尖吻蝮蛇毒組小鼠、AaHⅣ組小鼠和PBS組小鼠進(jìn)行攻毒。24小時后AaHⅣ免疫組死亡3只,尖吻蝮蛇毒免疫組死亡

12、1只,PBS組全部死亡(n=10)。Fisher’s Exact test方法統(tǒng)計分析提示,尖吻蝮蛇毒免疫組和AaHⅣ免疫組小鼠死亡率沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.58)。尖吻蝮蛇毒免疫組和AaHⅣ免疫組小鼠均與PBS組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。
　　新鮮純化的AaHⅣ蛋白2LD50劑量采用腹腔注射的方法對AaHⅣ、AaHⅣ催化結(jié)構(gòu)域片段和非催化結(jié)構(gòu)域片段和PBS組小鼠進(jìn)行攻毒。24小時后AaHⅣ免疫組存活9只,催化結(jié)構(gòu)域片段

13、免疫組存活8只,非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組存活2只,PBS組存活0只(n=10)。AaHⅣ免疫組和催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組小鼠死亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組和非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組之間(p<0.05),非催化結(jié)構(gòu)域片段免疫組與AaHⅣ免疫組之間(P<0.001)均存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　四、結(jié)論:
　?、貯aHⅣ具有免疫原性和抗原性,其免疫小鼠產(chǎn)生的抗體能夠具備對尖吻蝮蛇粗毒的中和活性,可以作為制備抗蛇毒血清