全人源炭疽保護(hù)性抗原中和抗體的研究.pdf

1、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)致死率極高，是人畜共患烈性傳染病-炭疽病(Anthrax)的病原體。并且炭疽桿菌來源廣泛、易于培養(yǎng)，被作為一種A類生物戰(zhàn)劑進(jìn)行管理，其防生和反恐一直以來都具有重要的軍事意義和社會(huì)意義。炭疽的防控手段包括預(yù)防和治療，二者分別主要依賴于炭疽疫苗和抗菌素，但是這兩種藥物均需在感染前或感染初期立即使用。而炭疽毒素中和抗體在宿主感染后期，仍然能有效中和體內(nèi)產(chǎn)生的炭疽毒素，同時(shí)發(fā)揮補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性

2、作用和抗體依賴細(xì)胞毒性作用，是目前最有前景的炭疽治療藥物。
　　自從1975年雜交瘤技術(shù)出現(xiàn)后，多年來單抗治療主要依賴于鼠源單抗，但是鼠源性單抗半衰期短、毒副作用明顯，大大制約了其臨床應(yīng)用。全人源單克隆抗體應(yīng)用于人體時(shí)具有無免疫原性、半衰期長(zhǎng)，國(guó)外大多數(shù)新開發(fā)項(xiàng)目現(xiàn)已轉(zhuǎn)向全人源單抗的研發(fā)。目前全人源單抗制備的方法主要是通過人人雜交瘤技術(shù)、轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)、抗體庫(kù)技術(shù)和單細(xì)胞PCR技術(shù)，其中通過單細(xì)胞PCR技術(shù)可直接從人單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增

3、抗體基因，無需細(xì)胞融合培養(yǎng)和抗體多輪篩選的過程，能夠在最短7天內(nèi)篩選獲得有效的全人源單抗，而其他幾種抗體制備方法均需要數(shù)周甚至數(shù)月，建立這種快速高通量抗體篩選平臺(tái)，將有助于提升我國(guó)新發(fā)突發(fā)傳染病的應(yīng)對(duì)能力;并且，單細(xì)胞PCR技術(shù)完整保留了抗體重鏈輕鏈在人體內(nèi)的天然配對(duì)方式，因此可在獲得治療抗體的同時(shí)更加直觀、深入地研究人體免疫機(jī)制。但是，由于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因拷貝數(shù)非常低，單細(xì)胞PCR技術(shù)的實(shí)現(xiàn)非常困難，目前國(guó)內(nèi)罕見成功通過該技術(shù)獲得單抗的

4、研究團(tuán)隊(duì)。
　　目前大部分炭疽單抗仍然是鼠源單抗，少數(shù)研究者從大猩猩、轉(zhuǎn)基因鼠和人體中篩選獲得了炭疽單抗，而我國(guó)仍未見全人源的炭疽毒素單抗報(bào)道。鑒于炭疽毒素作用機(jī)制的復(fù)雜性，研發(fā)更多的針對(duì)不同中和表位的炭疽全人源單抗，能夠有效避免炭疽毒素被人為突變帶來的生物恐怖威脅，為炭疽的治療提供更多選擇。鑒于此，本文目的在于建立流式分選-單細(xì)胞PCR快速高通量的抗體篩選技術(shù)平臺(tái)，并通過該技術(shù)平臺(tái)從重組炭疽保護(hù)性抗原(protective an

5、tigen，PA)疫苗免疫的志愿者體內(nèi)，篩選獲得全人源PA中和抗體，并對(duì)單抗的親和力、抗原結(jié)合表位、毒素中和機(jī)制、單抗聯(lián)合用藥效果等進(jìn)行深入研究。
　　首先對(duì)一名男性志愿者在第0天和28天兩次免疫了重組PA疫苗，并在第0、28、35天采集志愿者血液樣品。為確保能夠在合適的時(shí)間點(diǎn)采集志愿者陽(yáng)性的血液樣品，從而提高后續(xù)PA抗體篩選的陽(yáng)性率，本文通過ELISA和TNA的方法，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)血清中PA結(jié)合和中和抗體滴度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表明，免

6、疫第35天血清中PA結(jié)合抗體和中和抗體滴度均明顯升高。同時(shí)，通過ELISpot的方法，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)血液中抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示分泌抗PA抗體的抗體分泌細(xì)胞占總分泌IgG抗體分泌細(xì)胞的比例，從免疫后第28天的0.8％上升至免疫后第35天的23.8％，可見分泌抗PA抗體的抗體分泌細(xì)胞個(gè)數(shù)大幅升高。表明重組PA疫苗在志愿者有效地激發(fā)人體體液免疫反應(yīng)，在免疫后第35天時(shí)體液免疫水平顯著升高，為后續(xù)抗體的分選提供保證。
　

7、　為了實(shí)現(xiàn)單個(gè)B細(xì)胞的分選和抗體基因的單細(xì)胞PCR擴(kuò)增，我們嘗試了多種細(xì)胞分選和單細(xì)胞PCR的方法，在經(jīng)歷多次失敗后，最終采用流式細(xì)胞分選抗體分泌細(xì)胞，以及多重引物組合的單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄-巢式兩步PCR的方法，成功從人單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增獲得抗體基因。在單細(xì)胞PCR條件優(yōu)化的過程中，我們發(fā)現(xiàn)引物設(shè)計(jì)、酶的種類和模板量對(duì)于擴(kuò)增效率的影響非常大，而退火溫度對(duì)于擴(kuò)增效果影響甚微。
　　在成功實(shí)現(xiàn)研究中抗體分選的關(guān)鍵性技術(shù)-流式分選單個(gè)抗體分泌細(xì)

8、胞和單細(xì)胞PCR技術(shù)后，采集了志愿者免疫后第35天的血液樣品，通過Ficoll-hypaque密度梯度離心法從血液樣品中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)，在對(duì)一組抗體分泌細(xì)胞表面特異的白細(xì)胞分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）分子進(jìn)行熒光染色后，通過流式細(xì)胞分選儀從PBMC中分選獲得2112個(gè)單個(gè)抗體分泌細(xì)胞克隆。通過本文前期建立的單細(xì)

9、胞PCR方法，對(duì)2112個(gè)單細(xì)胞克隆進(jìn)行抗體基因的PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，529個(gè)單細(xì)胞克隆的重鏈和輕鏈同時(shí)擴(kuò)增成功的陽(yáng)性率，即單細(xì)胞PCR的陽(yáng)性率約25％。在硬件條件滿足的情況下，僅需1～2天即可完成以上單細(xì)胞的分選和抗體基因擴(kuò)增的過程。
　　如果采用傳統(tǒng)的克隆方法，構(gòu)建529對(duì)抗體基因的表達(dá)質(zhì)粒，非常耗時(shí)費(fèi)力。為了快速、高通量表達(dá)抗體基因，我們?cè)O(shè)計(jì)了可直接通過PCR融合啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、抗體全長(zhǎng)基因、多聚A尾(poly(A) t

10、ail)的線性表達(dá)框。我們對(duì)線性表達(dá)框PCR條件進(jìn)行優(yōu)化，并使用一株對(duì)照抗體驗(yàn)證線性表達(dá)框所表達(dá)抗體的表達(dá)量和功能。結(jié)果顯示，經(jīng)線性表達(dá)框表達(dá)的抗體量可達(dá)0.4μg/mL，且良好保持了抗體中和效果，能夠滿足后續(xù)抗體篩選實(shí)驗(yàn)的要求，通過我們?cè)O(shè)計(jì)的線性表達(dá)框可在最短3天內(nèi)表達(dá)供后續(xù)篩選用的抗體。在確保方法的可行性后，我們按照優(yōu)化的重疊延伸PCR條件，構(gòu)建了529對(duì)抗體重鏈和輕鏈線性表達(dá)框，并將配對(duì)的基因共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。

11、繼而，通過ELISA和TNA的方法對(duì)529株全人源單抗進(jìn)行PA結(jié)合和中和活性的檢測(cè)，并鑒定了單抗的特異結(jié)合的PA結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，我們成功通過建立的抗體篩選平臺(tái)技術(shù)獲得34株P(guān)A結(jié)合單抗，其中4株單抗(2A6、4A3、8H6、22F1)具有PA中和活性。中和單抗22F1與PA不結(jié)合，而是通過與PA的變構(gòu)體PA63結(jié)合發(fā)揮作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)PA結(jié)合單抗中有一種能夠加速細(xì)胞死亡的毒素增強(qiáng)抗體(Toxinenhancing mAb)，占PA

12、結(jié)合單抗的比例達(dá)55.9％之多。
　　為了進(jìn)一步探究PA中和抗體和毒素增強(qiáng)抗體的特性，構(gòu)建4株P(guān)A中和抗體和1株毒素增強(qiáng)抗體8A7的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染并純化抗體蛋白;并從以下幾個(gè)方面對(duì)抗體的功能進(jìn)行研究:1）通過BLI技術(shù)測(cè)定了5株重點(diǎn)研究的單抗的親和力;2）測(cè)定4株中和單抗在體內(nèi)和體外的中和活性，結(jié)果顯示4株中和單抗中22F1單抗中和活性最強(qiáng)，其體外保護(hù)效果較上市PA單抗報(bào)道結(jié)果高出近一個(gè)數(shù)量級(jí)，而單抗2A6僅在體外具有保護(hù)活性;3

13、）鑒定中和單抗的中和機(jī)制，結(jié)果表明8H6單抗對(duì)PA呈現(xiàn)抗體濃度依賴的酶切抑制作用，4A3單抗通過促進(jìn)PA63的降解而抑制PA七聚體形成，4A3這種類似酶活作用的毒素中和機(jī)制尚未見報(bào)道，提示本研究可能發(fā)現(xiàn)了一株新中和機(jī)制的PA中和單抗。毒素增強(qiáng)單抗8A7能促進(jìn)PA七聚體的形成，提示其毒素增強(qiáng)作用的可能機(jī)制;4）分析單抗的聯(lián)合用藥效果，結(jié)果表明2A6和4A3、8H6和22F1表現(xiàn)出較弱的協(xié)同作用;2A6和8H6、2A6和22F1表現(xiàn)出無關(guān)作

14、用;4A3和8H6、4A3和22F1表現(xiàn)出拮抗作用。而單抗聯(lián)合用藥協(xié)同效果最為顯著的，是毒素增強(qiáng)單抗8A7與僅在體外具有中和活性的單抗2A6，二者聯(lián)合用藥能夠在體內(nèi)發(fā)揮高水平的毒素中和效果。結(jié)果提示我們，在人體內(nèi)之所以大量產(chǎn)生毒素增強(qiáng)抗體的可能原因是，這種抗體在血液中能夠輔助其他抗體發(fā)揮良好的機(jī)體保護(hù)效果。并且，8A7單抗針對(duì)的PA結(jié)構(gòu)域3是目前普遍認(rèn)為的PA非中和位點(diǎn)，根據(jù)本文所得結(jié)果推測(cè)針對(duì)PA結(jié)構(gòu)域3表位的單抗，在人體內(nèi)能夠通過與

15、其他抗體協(xié)同發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，這種輔助性單抗在抗體篩選過程中容易被遺漏，但是其在“雞尾酒”治療中發(fā)揮的重要作用不容忽視。
　　綜上所述，本文建立了基于流式分選和單抗PCR技術(shù)的快速抗體篩選平臺(tái)，能夠?yàn)樾掳l(fā)突發(fā)傳染病抗體研究提供技術(shù)儲(chǔ)備;篩選制備了多株不同中和機(jī)制的全人源PA中和單抗，其中包含新中和機(jī)制的單抗和高中和活性的單抗，是非常有前景的炭疽治療藥物;同時(shí)，對(duì)抗體中和機(jī)制、表位、聯(lián)合用藥效果的研究，也為炭疽毒素作用機(jī)理研究、