炭疽芽胞桿菌治療性抗體的初步研究.pdf

1、炭疽是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，接種炭疽疫苗是預(yù)防炭疽的有效手段，但是疫苗產(chǎn)生保護(hù)性免疫需要一定時(shí)間，在疾病流行和某些突發(fā)事件發(fā)生時(shí)無法提供有效的緊急免疫防護(hù)。而中和性抗體作為被動免疫制劑可以彌補(bǔ)炭疽疫苗的不足，直接提供有效的保護(hù)。 因此，本研究選擇在中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞中表達(dá)具有中和活性的抗炭疽芽胞桿菌重組保護(hù)性抗原(recombinant protectiveantige

2、n，rPA)的嵌合抗體，為炭疽的治療提供被動免疫制劑。 首先克隆3株具有中和活性的抗炭疽芽胞桿菌重組保護(hù)性抗原(rPA)的鼠源單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的V<,L>和V<,H>基因。對獲得的可變區(qū)基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，初步判斷為鼠的免疫球蛋白(Immunoglobin，Ig)基因。 為了快速驗(yàn)證獲得的可變區(qū)基因是否具有生物學(xué)活性，將5E1和482的V<,L>、V<,H>基因分別通

3、過(Gly4Ser)<,3>的連接肽融合構(gòu)建了scFv基因，在大腸桿菌中表達(dá)并純化了單鏈抗體，實(shí)驗(yàn)表明scFv能夠與rPA特異結(jié)合，且在細(xì)胞模型上具有中和活性，為表達(dá)具有中和活性的嵌合抗體奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 為表達(dá)全分子嵌合抗體，通過重疊延伸PCR技術(shù)將5E1的V<,H>、V<,L>基因分別與人IgGl亞類的C<,H>和C<,K>基因融合，構(gòu)建了完整人一鼠嵌合抗體基因。將人一鼠嵌合抗體基因克隆到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)(mutiple

4、 cloning site，MCS)，構(gòu)建了嵌合抗體的表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0/dhfr<'->(DG44)細(xì)胞，經(jīng)氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)初步加壓(MTX濃度為5×10<'-8>mol/L)篩選，獲得最高表達(dá)量為18 mg/L的細(xì)胞株。對此細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并純化嵌合抗體。純化的嵌合抗體在非還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約150kD的帶，在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條約50kD和一條約25kD的帶；W

5、estern印跡結(jié)果顯示，全分子蛋白和重鏈(heaVy chain，H鏈)分子均可與羊抗人IgG Fc發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；全分子蛋白和還原后的輕鏈(light chain，L鏈)重鏈(high chain，H鏈)分子均可與羊抗人IgG發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。ELISA檢測結(jié)果顯示，純化的嵌合抗體與rPA發(fā)生反應(yīng)，說明表達(dá)的嵌合抗體保留了親本鼠源mAb的抗原結(jié)合活性。在毒素作用的J774A.1細(xì)胞模型和Fisher 344大鼠模型上，純化的嵌