地衣芽胞桿菌中桿菌肽及普切明酸的合成調控研究.pdf

1、非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptides synthetases,NRPSs)和環(huán)二肽合成酶(cyclodipeptides synthetases,CDPSs)是微生物中的兩種非核糖體肽合成酶類。經(jīng)由NRPS途徑合成的桿菌肽和經(jīng)由CDPS途徑合成的普切明酸是地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)中具有代表性的非核糖體肽類抗菌物質。但是,目前對于兩種物質合成途徑的轉錄調控還缺乏了解,阻礙了我們

2、對菌株的桿菌肽和普切明酸應用潛力的挖掘。本論文以桿菌肽工業(yè)生產(chǎn)菌株B.licheniformis DW2為研究對象,通過基因重組技術、RT-qPCR、凝膠阻滯分析等方法,考察不同轉錄調控因子在桿菌肽及普切明酸合成過程中的作用,驗證了Spo0A-AbrB-SigH調控系統(tǒng)在NRPS成途徑中的地位,并首次較完整的揭示了芽胞桿菌中CDPS合成途徑的調控網(wǎng)絡。本研究得到的主要結論如下:
　　1.Spo0A-AbrB-SigH調控系統(tǒng)對桿菌

3、肽合成的調控作用
　　bacT為假定的Ⅱ型硫酯酶基因,該基因的缺失不會影響桿菌肽合成酶操縱子bacABC的轉錄,但是會導致桿菌肽合成效率降低,并使桿菌肽產(chǎn)量下降83.01％,表明該假定的Ⅱ型硫酯酶(BacT)是桿菌肽合成酶系的組成部分。
　　地衣芽胞桿菌中桿菌肽合成基因的轉錄受到Spo0A-AbrB-SigH調控系統(tǒng)的調控。AbrB是bacT和bacABC的直接負調控因子。在abrB基因缺失或者轉錄受到抑制的菌株(DW2Δa

4、brB、DW2Δ0AΔabrB、DW2Δ0A/pHY-sad67)中,bacT和bacA基因的轉錄水平都有不同幅度的提升,單位菌體的桿菌肽產(chǎn)量相比于DW2菌株分別提升19.32％、25.60％和24.15％。在abrB基因表達量較高的菌株(DW2Δ0A、DW2Δabr B/pHY-abrB)中,bacT和bacA基因的轉錄水都被抑制,桿菌肽合成停止。凝膠阻滯實驗證明AbrB蛋白可以與bacT和bacA基因的啟動子結合,表明AbrB是該基

5、因的直接負調控因子。在DW2Δ0AΔabrB菌株基礎上敲除sigH基因后,bacT、bacA基因的轉錄水平以及菌株的桿菌肽產(chǎn)量并未出現(xiàn)顯著變化,表明SigH沒有獨立參與桿菌肽的合成調控。
　　2.AbrB-YvnA-YvmB調控系統(tǒng)對普切明酸合成的調控作用
　　abrB基因的缺失導致普切明酸的合成時間提前4h,產(chǎn)量相對于DW2菌株提升103.16％,yvmC、yvnA和yvmA基因的轉錄水平不同程度上調,而yvmB基因的轉錄

6、則被抑制。DW2/pHY-abrB菌株的普切明酸合成停止,yvmC、yvnA和yvmA基因的轉錄被抑制,而yvmB基因的轉錄水平上升。凝結阻滯分析證實AbrB是yvmC-cypX基因簇和yvnA基因的直接負調控因子,而對yvmA和yvmB基因為間接調控。DW2ΔyvmB菌株中的普切明酸產(chǎn)量相比于DW2菌株提升60.12％,yvmC和yvmA基因的轉錄水平相對DW2上調。DW2/pHY-yvmB菌株無法合成普切明酸,yvmC和yvmA基因

7、的轉錄也受到抑制。凝結阻滯實驗證實YvmB是yvmC-cypX基因簇和yvmA基因的直接負調控因子。DW2ΔyvnA和DW2/pHY-yvnA菌株均不合成普切明酸,普切明酸合成基因簇的轉錄都受到抑制。但是在DW2ΔyvnA中yvmB基因轉錄水平上升,而在DW2/pHY-yvnA菌株中yvmB基因轉錄水平下降。在DW2ΔyvnA菌株中敲除yvmB后,菌株的桿菌肽合成能力恢復。凝膠阻滯實驗證實,YvnA蛋白通過直接結合的方式抑制yvmC和y

8、vmB的轉錄,并間接激活yvmA的表達?？傮w而言,AbrB、YvnA和YvmB皆為普切明酸合成操縱子yvmC-cypX的負調控因子,同時AbrB也是yvnA基因的直接負調控因子,而YvnA則是yvmB基因的直接負調控因子。
　　YvmA蛋白則與普切明酸的分泌有關,yvmA基因的缺失會導致菌株細胞內普切明酸的積累增加。
　　3.地衣芽胞桿菌的普切明酸免疫機制
　　在各個菌株基礎上構建其yvmC缺失的對照菌株,并考察各個菌