源于地衣的蘇云金芽胞桿菌分離及對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)生測(cè)和活性因子的研究.pdf

1、本研究以非維管植物地衣為分離材料，采用抗生素加醋酸鈉熱處理的方法，從48個(gè)地衣樣本中分離到6株蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)，編號(hào)為BRC-ZQL1至BRC-ZQL6。
　　 為了解其生物學(xué)特性，分別對(duì)這6個(gè)菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定，結(jié)果顯示：這些菌株在生理生化指標(biāo)上都存在著一定差異。通過(guò)cry基因PCR--RFLP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：6個(gè)菌株均含有cry1基因(cry1Ad、cry1Ba、cry1Cb、

2、cry1Da、cry1Ea)；5個(gè)菌株含有cry2基因(cry2Ac、cry2Ah)；這些菌株還含有cry9、cry1Ⅰ等基因。BRC--ZQL5、BRC--ZQL6菌株的PCR--RFLP圖譜出現(xiàn)特異性片段，推測(cè)其存在新基因。
　　 選用BRC--ZQL1至BRC--ZQL6和實(shí)驗(yàn)室保存的3個(gè)菌株(Bt8010、Bt HD1、Bt010)，以不同濃度菌液對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)(Angiostrongylus cantonensis)進(jìn)

3、行殺蟲(chóng)活性初步鑒定，發(fā)現(xiàn)不同菌株毒性存在較大差異，其中BRC--ZQL3殺蟲(chóng)效果最好。提取BRC--ZQL3伴孢晶體蛋白對(duì)A.cantonensis進(jìn)行生測(cè)，處理24 h和48 h的LC50分別為2.85415和1.10599 mg/mL，表明BRC--ZQL3對(duì)A.cantonensis具有較明顯的殺蟲(chóng)活性。
　　 以BRC-ZQL3總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)該菌株的cry2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物與克隆載體連接，得到

4、重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序可知目的基因ORF為1899 bp。將該基因序列提交NCBI(GenBank登錄號(hào)：FJ550343.1)，國(guó)際Bt命名與分類(lèi)委員會(huì)將其命名為cry2Ah2基因，其為一個(gè)新基因。用生物信息學(xué)軟件分析該基因，其蛋白由632個(gè)氨基酸組成，分子量約為70.84 kDa；對(duì)該蛋白進(jìn)行了同源比對(duì)和理化性質(zhì)分析，同時(shí)預(yù)測(cè)了二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。
　　 構(gòu)建表達(dá)載體pGEX--cry2Ah2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌

5、(E.coli) BL21(DE3)，得到具有重組質(zhì)粒pGEX-cry2Ah2的BL21(DE3)，SDS-PAGE結(jié)果證明cry2Ah2基因能在該重組菌中成功表達(dá)。
　　 將重組大腸桿菌IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，用其菌裂解液對(duì)A.cantonensis進(jìn)行毒力測(cè)定，24 h和48 h的校正死亡率分別為12.77％和22.91％，證明Cry2Ah2蛋白對(duì)A.cantonensis具有一定程度的毒性，但其殺蟲(chóng)活性不高，這也表明BRC-ZQ

6、L3還存在其它的殺蟲(chóng)活性因子。
　　 為提高BRC-ZQL3產(chǎn)孢水平，應(yīng)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)基配方為：黃豆餅粉2％、玉米粉0.42％、酵母膏0.39％、磷酸二氫鉀0.025％、七水硫酸鎂0.035％、碳酸鈣0.04％、初始pH值為7.2。優(yōu)化后BRC-ZQL3產(chǎn)孢水平達(dá)到3.92×10-8 mL-1與響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型的預(yù)測(cè)值只有2.9％的誤差，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢水平提高了60.66％。