蘇云金芽胞桿菌分離鑒定及對馬鈴薯二十八星瓢蟲特異活性菌株研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)是世界上研究最多應(yīng)用范圍最廣的殺蟲微生物,殺蟲活性物質(zhì)包括Cry和Cyt兩大類蛋白,在害蟲生物防治中發(fā)揮了重要作用,但是也暴露了一些弊端,如殺蟲譜窄、昆蟲易產(chǎn)生抗性等問題,所以進一步分離特異活性或者高活性的野生菌株,鑒定其基因型,為害蟲防治提供更多的基因資源。
　　 本論文針對含有cry7類基因的蘇云金芽胞桿菌野生菌株進行了鑒定和評價,從中篩選出了對馬鈴薯二十八星瓢蟲特異活性的新菌株,針對這一新菌株生物學(xué)特

2、性、蛋白型、基因型以及作用機理等方面進行了一系列的研究,主要內(nèi)容和結(jié)果如下。
　　 1.利用醋酸鈉篩選法并經(jīng)基因型分析,從河北省土壤中分離篩選出了56株含有cry7基因的Bt菌株。在這些菌株中,10株菌同時含有cry7基因和其他cry基因,46株菌只含有單一cry7基因。大部分Bt菌株表達130kDa蛋白,僅有BQZ-12菌株產(chǎn)生80kDa和70kDa蛋白,BQZ-8菌株產(chǎn)生130kDa和80kDa蛋白。通過生物活性測定得到一株

3、對馬鈴薯二十八星瓢蟲幼蟲具有特異殺蟲活性野生菌Bt WZ-9。
　　 2.WZ-9菌株在胞晶分離期產(chǎn)生菱形伴胞晶體,蛋白分子量為130kDa,對馬鈴薯二十八星瓢蟲2齡幼蟲的LC50值為0.209 mg/ML?；蛐丸b定結(jié)果表明該菌只含有單一的cry7基因,序列分析顯示該基因與cry7Ab1同源性達到99％,被Bt命名委員會命名為cry7Ab3(登錄號ABX24522)。
　　 3.為了明確Cry7Ab3蛋白的殺蟲活性,從

4、Bt WZ-9菌株中克隆了cry7Ab3基因,該基因在大腸桿菌:BL21和Bt無晶體突變株HD73 cry中都能正確表達130kDa蛋白,其表達產(chǎn)物對馬鈴薯二十八星瓢蟲2齡幼蟲都具有較高毒力,LC50值分別為0.460mg/Ml和0.205mg/Ml,cry7Ab3基因在轉(zhuǎn)Bt無晶體突變株HD73-Cry7Ab3中形成的晶體(0.86μmx1.23μm)比野生菌產(chǎn)生的晶體(0.73μm×1.00μm)略大一些。這些結(jié)果證實了cry7Ab

5、3基因編碼蛋白發(fā)揮殺蟲作用。
　　 4.為明確Cry7Ab3蛋白最短活性區(qū)序列,利用特異性引物分別克隆表達不同長度的cry7Ab3基因片段,E coli Cry7Ab3-1(Metl-Phe657)、E coli Cry7Ab3-2(Metl-Phe626)、E coli Cry7Ab3-3(Asn30-Phe657)和E coli Cry7Ab3-4(Lys87-Phe657),并測定了表達產(chǎn)物對馬鈴薯二十八星瓢蟲2齡幼蟲的毒

6、力。結(jié)果表明E coli Cry7Ab3-1表達的75kDa蛋白毒力最高,LC50值為0.114mg/ML,可以確定Metl-Phe657為Cry7Ab3蛋白的最短活性區(qū)。
　　 5.分別利用胰蛋白酶和馬鈴薯二十八星瓢蟲中腸蛋白酶液體外酶解130kDa的Cry7Ab3原毒素(質(zhì)量比為100:1),均得到75kDa的酶解產(chǎn)物。與相同濃度的原毒素相比,75kDa的酶解產(chǎn)物對馬鈴薯二十八星瓢蟲2齡幼蟲具有較高殺蟲毒力。對馬鈴薯二十八星

7、瓢蟲幼蟲中腸組織病理學(xué)研究表明,3齡幼蟲取食Cry7Ab3原毒素蛋白3d后,中腸細胞嚴(yán)重破壞,細胞間出現(xiàn)明顯孔洞,幼蟲表現(xiàn)出活動緩慢,取食量下降的現(xiàn)象。取食5d后,中腸組織完全被破壞,幼蟲開始死亡。通過Ligand blotting技術(shù),檢測到馬鈴薯二十八星瓢蟲中腸BBMV上存在分子量為220kDa的Cry7Ab3毒素結(jié)合受體,經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定該受體蛋白為鈣粘蛋白。
　　 本論文創(chuàng)新之處在于發(fā)現(xiàn)了對馬鈴薯二十八星瓢蟲幼蟲特異活性的