蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1520基因組中TA系統(tǒng)的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)菌株YBT-1520的全基因組測(cè)序結(jié)果表明它含有1條染色體和11個(gè)質(zhì)粒。毒素抗毒素系統(tǒng)(TA系統(tǒng))最初是在大腸桿菌的低拷貝大質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的，此后的研究多集中于G細(xì)菌的大質(zhì)粒上，對(duì)G+的質(zhì)粒尤其是小質(zhì)粒的研究非常少。本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了562條毒素或者抗毒素蛋白質(zhì)的序列，通過(guò)窮舉比對(duì)在YBT-1520基因組上發(fā)現(xiàn)了多種TA系統(tǒng)。 1.質(zhì)粒pBMB8240上潛在TA

2、系統(tǒng)五kyAB的研究 本研究在YBT-1520菌株中發(fā)現(xiàn)了新質(zhì)粒pBMB8240上有兩個(gè)鄰近的開(kāi)放讀碼框，分別命名為KyA和KyB蛋白，通過(guò)序列分析，發(fā)現(xiàn)KyA和KyB分別與已知抗毒素、毒素蛋白有序列一致性。 KyA和KyB基因的克隆實(shí)驗(yàn)表明kyA基因很容易克??；而多次努力克隆到的kyB基因區(qū)域都發(fā)生了基因突變。KyAB系統(tǒng)裝載到不穩(wěn)定的載體pBMB0631上去之后發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大升高。 以上結(jié)果表明ky

3、AB系統(tǒng)是一個(gè)潛在的TA系統(tǒng)，并且能夠增強(qiáng)不穩(wěn)定質(zhì)粒的穩(wěn)定性。這是第一個(gè)克隆到大腸桿菌中的來(lái)自蘇云金芽胞桿菌的質(zhì)粒TA系統(tǒng)。 2.質(zhì)粒pBMB7635上潛在TA系統(tǒng)kyCD的研究 本研究發(fā)現(xiàn)YBT-1520中的質(zhì)粒pBMB7635與本實(shí)驗(yàn)室以前克隆的質(zhì)粒pBMB9741有很高的相似性，對(duì)pBMB7635重新測(cè)序，并將質(zhì)粒pBMB9741重新命名為pBMB7635。 質(zhì)粒pBMB7635上有兩個(gè)鄰近的開(kāi)放讀碼框，與

4、已經(jīng)鑒定的TA系統(tǒng)有較高相似性，將這兩個(gè)分別編碼94和133個(gè)氨基酸大小的蛋白質(zhì)分別命名為KyC和KyD蛋白。 KyC、kyD和kyCD系統(tǒng)及臨近區(qū)域的克隆實(shí)驗(yàn)表明kyC基因很容易克隆；而多次努力克隆kyD基因和kyCD系統(tǒng)及臨近區(qū)域只得到少量轉(zhuǎn)化子，而且這些轉(zhuǎn)化子中kyD區(qū)域都發(fā)生了基因突變，表明kyCD很可能是TA系統(tǒng)，且不能在大腸桿菌中克隆。 3.質(zhì)粒pBMB2062的克隆和分析 克隆并分析了菌株YBT-1

5、520中的多拷貝小質(zhì)粒pBMB2062，序列分析表明，pBMB2062含有2個(gè)ORFs(大于75個(gè)氨基酸)，缺失實(shí)驗(yàn)證明ORF1(289aa)對(duì)于質(zhì)粒在芽胞桿菌中的復(fù)制和穩(wěn)定是必需的，ORF2則不是。研究隨機(jī)選取了7個(gè)不同血清型菌株的小質(zhì)粒進(jìn)行了克隆和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這些小質(zhì)粒的序列高度保守。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)表明該質(zhì)粒在目前鑒定的84個(gè)Bt血清型菌株中的分布為41％。 4.YBT-1520染色體上mazEF系統(tǒng)的克隆和分析 在YB

6、T-1520染色體上找到一對(duì)mazEF系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)mazEF系統(tǒng)進(jìn)行了敲除突變，改變MazEF的表達(dá)水平來(lái)探索MazEF的表達(dá)與PCD之間的的相互作用，從而進(jìn)一步研究mazEF的功能。研究發(fā)現(xiàn)，敲除了mazEF系統(tǒng)的菌株在45℃培養(yǎng)4天之后，菌體量逐漸減少，取樣鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體大部分死亡。從另外一個(gè)角度證明了染色體上的mazEF系統(tǒng)在PCD中起作用。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因組間上TA系統(tǒng)的比較分析，為進(jìn)一步研究質(zhì)粒在不同菌株(包括其它芽胞