蘇云金芽胞桿菌YBt-020晶胞粘連相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，能形成伴胞晶體和芽胞。在芽胞成熟后，母細胞裂解，此時絕大多數(shù)Bt的晶體與芽胞分離，而少數(shù)Bt（如幕蟲亞種）的晶體在芽胞外壁內(nèi)側(cè)形成而與芽胞不分離，我們稱之為晶胞粘連(Spore-Crystal Association，簡稱SCA)，其晶體稱為粘連晶體。
　　國內(nèi)外對SCA的研究進展目前主要集中在本課題組對Bt暮蟲亞種YBT-020的研究上，已

2、確定了粘連晶體定位在芽胞外壁“帽子結(jié)構(gòu)”內(nèi)側(cè)，其決定因子是大質(zhì)粒pBMB28上的兩個基因scaA和scaB，維持SCA穩(wěn)定的因子是scaC、scaD和scaE基因。還證明了粘連晶體的主要成分是晶體蛋白Cry26Aa（其基因位于大質(zhì)粒pBMB26上）。另外發(fā)現(xiàn)在僅有芽胞外壁“帽子結(jié)構(gòu)”存在時就可導(dǎo)致晶體粘連，但需要完整的芽胞外壁才能維持粘連表型的穩(wěn)定。但ScaA和ScaB如何將以Cry26Aa蛋白為主的粘連晶體定位到芽胞外壁和芽胞衣之間仍

3、然未知，推測ScaA、ScaB蛋白通過與Cry26Aa蛋白直接或間接的相互作用決定晶體的定位。但本課題組前期通過酵母雙雜交和斑點雜交等技術(shù)均沒有檢測到ScaA、ScaB蛋白與Cry26Aa蛋白間的直接相互作用，本研究在此基礎(chǔ)上展開，主要成果如下。
　　1、通過細菌雙雜交、Ligand Blot和GST Pull Down技術(shù)證明了Cry26Aa和ScaA、ScaB蛋白間的直接相互作用，為解決ScaA、ScaB蛋白決定粘連晶體定位的

4、機制提供一個直接有效的證據(jù)。
　　2、通過細菌雙雜交技術(shù)篩選和構(gòu)建了YBT-020中與SCA相關(guān)的芽胞外壁、芽胞衣蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。將從YBT-020中預(yù)測到的芽胞外壁和芽胞衣蛋白基因以及scaA、scaB、scaC、scaD和scaE等共87個基因構(gòu)建成細菌雙雜交靶標篩選文庫，從中篩選到與Cry26Aa、ScaA和ScaB蛋白有相互作用的蛋白分別為26、23和5個，并以這些蛋白為誘餌繼續(xù)從文庫中篩選，得到1236對相互作用，

5、將所有得到的相互作用通過Cytoscape軟件繪制成蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。
　　3、在構(gòu)建的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上結(jié)合蛋白的功能，我們推測BclA、BclB、ExsFB、BxpB、CotY、ExsY、ExsB、CotE、YaaH、InH2和Yckk2等蛋白可能是影響SCA表型的關(guān)鍵蛋白，并通過基因敲除驗證了BclA2-2、Yckk2、BclB和YaaH蛋白是影響SCA的關(guān)鍵蛋白。
　　4、結(jié)合SCA相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、已確定的影

6、響SCA的關(guān)鍵蛋白以及Cry26Aa與ScaA、ScaB蛋白間的直接相互作用，推測出粘連晶體的定位模型。首先CotY蛋白組裝帽子結(jié)構(gòu)基本骨架，接著BclA、BxpB、ExsFB等蛋白的組裝形成完整的帽子結(jié)構(gòu)，期間ScaA、Cry26Aa通過與BclA等蛋白間的相互作用聚集到帽子結(jié)構(gòu)，在ScaA、ScaB蛋白及帽子結(jié)構(gòu)共同作用下使Cry26Aa逐步形成晶核，并最終形成粘連晶體。這為全面揭示SCA形成的動態(tài)過程提供了重要信息;同時，此蛋白互

7、作網(wǎng)絡(luò)展現(xiàn)了芽胞外壁、芽胞衣和晶體間在分子水平的聯(lián)系，為揭示芽胞外壁、芽胞衣的形成機制和芽胞與晶體共發(fā)育模式機制的研究打下基礎(chǔ)。
　　此外，提出發(fā)掘不同具有SCA的Bt菌株的不同粘連決定因子的新思路，即篩選同時與粘連晶體蛋白及與其有相互作用的芽胞外壁和芽胞衣蛋白有直接相互作用的蛋白，這些蛋白便是潛在的粘連決定因子，進一步通過對其基因敲除可以進行驗證。這將會加快解決更多Bt不同SCA的形成機制，促進SCA形成的普遍機制的研究，進而為