蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1518新型殺線蟲晶體蛋白基因分離的新策略.pdf

1、本研究建立了一種克隆蘇云金芽胞桿菌的殺蟲晶體蛋白基因的新方法。該方法的主要步驟為，先以一種蘇云金芽胞桿菌無質(zhì)粒無晶體突變株為宿主菌，利用穿梭載體，構(gòu)建野生型蘇云金芽胞桿菌菌株的質(zhì)粒DNA文庫，然后通過顯微鏡觀察和SDS-PAGE檢測的方法篩出選能夠形成晶體的菌株。通過這種方法，本研究從蘇云金芽胞桿菌野生型菌株YBT-1518中篩選到了三個晶體蛋白基因--cry55Aα1、cry6Aα2和cry5Bα2。菌株YBT-1518為我室分離的對

2、北方根結(jié)線蟲有高毒力的菌株。該菌株能夠在其芽胞期產(chǎn)生長米粒狀的晶體；晶體的成分通過SDS-PAGE檢測主要由45 kDa和54 kDa的蛋白組成。45 kDa的蛋白的編碼基因cry55Aα1與任何已知的cry基因之間都沒有相似性，為一種新的殺蟲晶體蛋白基因。該基因能夠在蘇云金芽胞桿菌無質(zhì)粒無晶體突變株BMB171中獨立表達并且累積形成與出發(fā)菌株YBT-1518相同的長米粒狀的伴胞晶體；基因cry5Bα2在宿主BMB171中同樣可以獨立表

3、達，但其產(chǎn)生的晶體則為菱形，SDS-PAGE檢測顯示其主要成分為140 kDa的蛋白。研究表明，在菌株YBT-1518中從來沒有觀察到過菱形的晶體或者140 kDa的晶體蛋白，這就說明晶體蛋白基因cry5Bα2在其出發(fā)菌株的表型是隱蔽的。生物測定表明，這三種晶體蛋白對北方根結(jié)線蟲都有活性。
　　 研究表明，在菌株YBT-1518中，基因cry55Aα1和cry6Aα2均定位于該菌中可檢測到的最小的質(zhì)粒上。該質(zhì)粒被命名為pBMB0

4、228。測序結(jié)果顯示，質(zhì)粒pBMB0228全長17，732 bp，G+C％為29.5％。該質(zhì)粒編碼有前面提到的兩種晶體蛋白基因--cry55Aα1和cry6Aα2,同時還編碼有Cry6A類蛋白基因cry6A-like和cry6Aα2的負調(diào)控因子R2蛋白類似蛋白的編碼基因R2-like。此外，該質(zhì)粒還編碼兩種類型的Rep蛋白--類似于Rep14-3的Rep0228和類似于RepL的RepL0228以及兩種相互之間相性很高的Mob蛋白--M

5、ob02281和Mob02282,這兩種Mob蛋白的氨基酸序列之間的相似性的identity為86％。
　　 質(zhì)粒pBMB0228的功能驗證實驗表明，該質(zhì)粒上存在的兩種Rep蛋白在異源宿主BMB171中都能行使復(fù)制起始功能；該質(zhì)粒編碼的兩種Mob蛋白在自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAW63：：Tn5401的幫助下能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移，其轉(zhuǎn)移頻率接近于質(zhì)粒pBMBt1、pGI2和質(zhì)粒pTX14-3等質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率。
　　 基因cry5Bα2在菌株