蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry1Ca7分子設(shè)計(jì).pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的殺蟲(chóng)微生物，其殺蟲(chóng)活性主要來(lái)源于其在芽胞形成過(guò)程中產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白。殺蟲(chóng)晶體蛋白結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制是目前國(guó)內(nèi)外Bt研究的熱點(diǎn)；在了解殺蟲(chóng)晶體蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，可以通過(guò)分子設(shè)計(jì)來(lái)改變殺蟲(chóng)晶體蛋白的活性和殺蟲(chóng)譜，為轉(zhuǎn)基因植物或微生物提供新的基因來(lái)源。 本論文圍繞蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry1Ca7的同源建模、分子設(shè)計(jì)、突變蛋白的機(jī)理變化等方面進(jìn)行了一系列的研究，主要結(jié)果如下

2、： 通過(guò)重疊引物PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到Cry1Ca的13個(gè)突變體，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)，并對(duì)甜菜夜蛾進(jìn)行了生物活性的測(cè)定。結(jié)果表明絕大部分突變毒蛋白活性降低了，位于DomainⅡ內(nèi)的突變是439GGT440、N306R、W376F和P375F&P377Y；位于DomainⅢ內(nèi)的突變是F580S、R522E和R570G；只有位于DomainⅠ中的2個(gè)突變蛋白，R148G和F177S，產(chǎn)生了活性提高的突變毒蛋白，前者的活

3、性是Cry1Ca7的6倍，后者的活性是Cry1Ca7的2倍，其它突變的活性都降低了G138S，T221R，T221D和N251S。通過(guò)引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的方法得到Cry1Ca結(jié)構(gòu)域增加和減少的突變體，對(duì)甜菜夜蛾進(jìn)行了殺蟲(chóng)活性測(cè)定；D1123和D1231保持活性。D12.3a和D12.3b/c的活性完全喪失了。 將cry1Ca7半長(zhǎng)突變基因F177S連接到本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體CT-pSTK上，在Bt轉(zhuǎn)化體系中進(jìn)行表達(dá)，得到全長(zhǎng)表達(dá)的

4、BtF177S；另外，通過(guò)重疊引物PCR的方法，獲得全長(zhǎng)表達(dá)的BtF580S。生測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BtF177S的活性與Cry1Ca相當(dāng)，而B(niǎo)tF580S幾乎完全喪失了活性。 通過(guò)高效液相色譜的方法純化了Cry1Ca7、BtCry1Ca7+CT、BtF177S和BtF580S四種蛋白，與BBMV進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)和寡聚化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以看出，兩種突變蛋白的結(jié)合明顯比Cry1Ca7要弱些；通過(guò)寡聚化實(shí)驗(yàn)可以看出，突變蛋白與Cr

5、y1Ca7一樣，可以形成寡聚化。 將cry1Fa2全長(zhǎng)基因連接在pSTK上，并轉(zhuǎn)化了蘇云金芽胞桿菌無(wú)晶體突變株，得到的Cry1Fa2進(jìn)行對(duì)甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)分別進(jìn)行生物活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)，Cry1Fa2的活性對(duì)甜菜夜蛾只達(dá)到Cry1Ca7的1/12，而對(duì)棉鈴蟲(chóng)的活性只達(dá)到Cry1Ac的1/10。 Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白分子設(shè)計(jì)在Bt應(yīng)用和殺蟲(chóng)作用的分子機(jī)理研究方面具有理論意義和實(shí)用價(jià)值。通過(guò)對(duì)Cry1Ca7進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，獲得了活性提