蘇云金芽胞桿菌殺線蟲菌株的篩選及其活性因子研究.pdf

1、化學(xué)農(nóng)藥對(duì)農(nóng)業(yè)有害生物的防治雖然成效顯著，但是由于日益惡化的環(huán)境問題，微生物農(nóng)藥的使用是大勢(shì)所趨。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)制劑是目前應(yīng)用最為成功的一類微生物殺蟲劑，在植物病害防治方面也取得了一定的進(jìn)展。深入挖掘我國豐富的蘇云金芽胞桿菌資源，分離克隆新型高毒力的殺蟲蛋白基因，對(duì)構(gòu)建高效廣譜工程微生物和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 新秀麗小桿線蟲(Caenorhabdi

2、tis elegans)是蘑菇等真菌上的重要病原線蟲，同時(shí)也是一種模式生物，能夠在室內(nèi)培養(yǎng)。本試驗(yàn)采用大腸埃希氏菌飼養(yǎng)，獲得大量蟲源，建立了以C.elegans為生物測(cè)定指標(biāo)篩選高活力Bt菌株的技術(shù)路線，成功地篩選到高效活性菌株Bt010。從Bt010中克隆表達(dá)了兩類Bt毒性因子：晶體蛋白和幾丁質(zhì)酶，采用質(zhì)譜手段證實(shí)了幾丁質(zhì)酶的存在。該試驗(yàn)初步揭示了Bt侵染線蟲的機(jī)制，豐富了Bt侵染線蟲過程中的致病毒力因子幾丁質(zhì)酶的性質(zhì)及其酶基因，為研

3、究Bt侵染線蟲的機(jī)制提供了有益的佐證。 通過生物測(cè)定觀察線蟲對(duì)不同Bt菌株所產(chǎn)生的毒力反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在118株Bt中只有6株對(duì)線蟲有毒性，作用時(shí)間大約在36h左右，6株中Bt010最為理想，其LC50為0.498μg/ml。Bt010伴孢晶體以菱形和方形為主，對(duì)其基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該茵株的基因組中存在cry 1Ia，而未見預(yù)期含有的cry 5和cry 6等已知?dú)⒕€蟲的cry基因．根據(jù)cry 1I基因保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用

4、PCR技術(shù)擴(kuò)增出殺蟲晶體蛋白基因片段并在GenBaak登錄，登錄號(hào)為EF065179。對(duì)該基因克隆表達(dá)結(jié)合生測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)線蟲不產(chǎn)生毒性作用。提取BT 010的總蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到相似肽段推測(cè)其主要成分為幾丁質(zhì)酶。利用光學(xué)顯微鏡觀察，Bt010處理線蟲后，能不同程度地降低線蟲的活動(dòng)力，抑制線蟲生長，明顯破壞線蟲體壁的完整性。透射電鏡照片清楚表明Bt010能夠有效降解體表層，引起線蟲體壁結(jié)構(gòu)的劇烈變化。基于以上結(jié)果，根據(jù)幾丁

5、質(zhì)酶基因保守序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從Bt010中擴(kuò)增到幾丁質(zhì)酶Chitinase基因，該基因已在GenBank中登錄，登錄號(hào)為EU030625。對(duì)該基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，生測(cè)發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)線蟲具有一定程度的毒殺作用。Bt010在殺滅線蟲的過程中對(duì)線蟲DNA不造成損傷，可以作為Bt安全性實(shí)驗(yàn)的輔證。除了對(duì)模式線蟲Celegans有活性外，Bt010菌株對(duì)番茄根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)也有一定的防效，證明該菌株具潛在的應(yīng)用