副豬嗜血桿菌安徽株分型及tbpA基因的克隆表達(dá)和免疫保護(hù)作用的研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬的革拉斯氏?。℅lasser's disease）的病原體，豬上呼吸道的一種共棲菌，它可在特定條件下侵入機(jī)體而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病，該病已經(jīng)成為影響世界養(yǎng)豬業(yè)的最重要的細(xì)菌性疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。目前HPS已鑒定出15個血清型，但仍有大量的分離菌株無法定為任一血清型，同時各血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)，這都制約了副豬嗜

2、血桿菌病的有效防控及其疫苗的發(fā)展。
　　 本研究對安徽地區(qū)HPS分離株進(jìn)行KRG 血清型和ERIC-PCR、PCR-RFLP基因型分析，同時在預(yù)測HPS TbpA蛋白抗原表位的基礎(chǔ)上，將tbpA分段克隆、表達(dá)與鑒定，研究表達(dá)蛋白的免疫功能。本研究的主要目的是：(1)探討安徽地區(qū)HPS的血清學(xué)和分子流行病學(xué)特點(diǎn)，為有效防控Glasser's disease提供科學(xué)依據(jù)；(2)探討TbpA蛋白在HPS免疫過程中的作用，為尋找制備高效

3、廣譜HPS新疫苗的途徑提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)一、HPS安徽分離株KRG血清型及ERIC-PCR、PCR-RFLP基因型多態(tài)性研究
　　 自安徽省12個地區(qū)（或豬場）的發(fā)病豬（高熱、呼吸困難）分離鑒定了18株HPS，采用KRG、ERIC-PCR、PCR-RFLP對其進(jìn)行血清型和基因型分析。
　　 結(jié)果顯示，18株HPS中有10株可以確定血清型，其中以血清型4型最為流行，占27.78％（5/18），其次為14型和

4、13型分別占16.67％（3/18）和11.11％（2/18），此外尚有44.4％（8/18）的菌株不能進(jìn)行定型。ERIC-PCR將18株HPS分為11個基因型，其中IV為優(yōu)勢基因型，占27.78％（5/18），其次是II基因型和I基因型，分別占16.67％（3/18）和11.11％（2/18）；PCR-RFLP將18株HPS分為6個基因型，其中優(yōu)勢基因型為DBP、BAE和BBB，分別占44.44％（8/18）、22.22％（4/18）

5、和16.67％（3/18）；不能進(jìn)行血清學(xué)分型的菌株均得到有效的基因分型。
　　 結(jié)果表明，HPS在安徽地區(qū)豬群中普遍存在，血清型、基因型均呈多態(tài)性分布，HPS的KRG血清型、ERIC-PCR基因型、PCR-RFLP基因型三者之間均無明顯的相關(guān)性，而ERIC-PCR基因型與同一血清型菌株的來源相關(guān)，更能反映菌株的親緣關(guān)系，從分子水平上揭示不同菌株的遺傳距離，尤其是應(yīng)用于病原在豬場的場內(nèi)及場間的流行情況研究。
　　 實(shí)驗(yàn)二

6、、HPS tbpA基因的克隆、表達(dá)及其免疫保護(hù)作用的研究
　　 參照GenBan上登陸的HPS SH0165株tbpA基因序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物，采用PCR方法擴(kuò)增HPS(LJ3株)的tbpA基因，并預(yù)測其信號肽序列及主要的抗原表位，以不破壞其優(yōu)勢抗原表位的原則，將tbpA基因分為三段，分別設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆到pET-32a（+）表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-32a(+)-tbpA1、pET-32a(+)

7、-tbpA2和pET-32a(+)-tbpA3，轉(zhuǎn)化BL21后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳可見大小分別為62kD、54kD、44kD的目的蛋白。三段重組蛋白經(jīng)免疫印記檢測后顯示其均具有免疫反應(yīng)性，能與兔抗HPS（LJ3 株）高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 將三段重組蛋白及HPS（LJ3株）甲醛滅活菌體分別免疫小鼠后，用同源菌株對菌體免疫組、三個重組蛋白免疫組及對照組小鼠腹腔攻毒，菌體免疫組及TbpA1能分別提供40％及2