副豬嗜血桿菌IV型菌毛的初頻研究及pilA突變株的篩選.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是一種革蘭氏陰性菌。HPS是豬上呼吸道的一種常在菌，但在特定條件下能夠侵入機(jī)體并通過血腦屏障引起豬腦膜炎的發(fā)生。菌毛是分布在細(xì)菌周身細(xì)而短的絲狀物，通過電子顯微鏡可以觀察到大多數(shù)革蘭氏陰性菌表面存在該結(jié)構(gòu)。Ⅳ型菌毛作為菌毛的一種，其在粘附和侵入、DNA攝取及介導(dǎo)細(xì)菌穿過血腦屏障等方面發(fā)揮功能。
　　 本研究克隆和分析了HPS強(qiáng)毒分離株SH0

2、165以及17株參考菌株中Ⅳ型菌毛操縱子的序列，比較了各結(jié)構(gòu)基因的保守性和同源性，為研究不同的功能位點(diǎn)與菌毛致病性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。嘗試使用多種培養(yǎng)條件培養(yǎng)SH0165菌株，成功觀察到豬體內(nèi)分離的SH0165存在菌毛結(jié)構(gòu)，并通過Western blot驗(yàn)證了該結(jié)果。嘗試對(duì)菌毛基因簇中的菌毛素基因pilA進(jìn)行缺失，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)菌毛的體外表達(dá)及研究菌毛的功能提供幫助。本論文具體研究內(nèi)容如下：
　　 1、克隆并分析了菌毛操縱子的序列

3、r>　　 參照HPS SH0165全基因組序列，設(shè)計(jì)引物并克?、粜途倏v子序列，通過序列分析發(fā)現(xiàn)操縱子的結(jié)構(gòu)基因由四個(gè)ORF組成，分別為pilA、pilB、pilC和pilD，分別編碼170、462、399和222個(gè)氨基酸，通過基因序列分析發(fā)現(xiàn)，HPS17株標(biāo)準(zhǔn)菌株中pilA的序列同源性在85%以上，而且基因的保守性較高，而標(biāo)準(zhǔn)菌株pilB、pilC和pilD的序列同源性均在40%-50%左右。對(duì)其蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)pilA

4、基因與相近種屬的有關(guān)基因相似性較高。另外，PilA蛋白羧基端擁有相對(duì)保守的半胱氨酸殘基，該位點(diǎn)能夠形成二硫鍵并產(chǎn)生一個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，在Ⅳ型菌毛發(fā)揮功能時(shí)起到重要作用，而且是主要的抗原決定部位。
　　 2、PilA蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　 以SH0165菌株的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增pilA片段，將pilA與pET-28a連接轉(zhuǎn)化E.coli/BL21(DE3)菌株并進(jìn)行原核表達(dá)。利用透析的方法對(duì)表達(dá)在包

5、涵體中的PilA蛋白進(jìn)行純化，利用純化好的蛋白免疫BALB/c鼠進(jìn)行多克隆抗體的制備。間接ELISA和Western-blot分析表明抗體特異性良好，其中較高的效價(jià)為1:51200，可用于后續(xù)研究使用。
　　 3、菌毛在不同環(huán)境下的表達(dá)情況
　　 本研究嘗試使用多種培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn)菌毛的體外表達(dá)，如使用LB培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基以及化學(xué)成分限定培養(yǎng)基來培養(yǎng)HPS，但通過電鏡觀察均未觀察到菌毛的存在。使用細(xì)胞

6、與細(xì)菌共培養(yǎng)的方法，試圖誘導(dǎo)HPS菌毛的表達(dá)，未能達(dá)到預(yù)期結(jié)果。另外，將HPS在雞胚絨毛尿囊膜上傳代后進(jìn)行細(xì)菌的電鏡觀察，也未能觀察到菌毛的存在。
　　 用副豬嗜血桿菌感染健康豬，采集感染豬血清及各發(fā)病組織，從胸水中分離的細(xì)菌通過電子顯微鏡，觀察到了菌毛結(jié)構(gòu)的存在。
　　 4、Western blot驗(yàn)證PilA為體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白
　　 將純化好的PilA蛋白制備樣品，分別用康復(fù)豬血清、滅活苗免疫豬血清及健康豬血

7、清做為一抗來進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，在用康復(fù)豬血清做為一抗檢測蛋白PilA時(shí)，可以在大約20kD的位置看到一條清晰的條帶，而用滅活苗免疫豬血清和健康豬血清做為一抗進(jìn)行檢測時(shí)，在相同的位置沒有條帶出現(xiàn)。另外，利用PilA抗血清做為一抗來驗(yàn)證體外培養(yǎng)的HPS發(fā)現(xiàn)，SH0165菌株在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下并未檢測出有PilA蛋白的表達(dá)，綜上所述，PilA蛋白只有在宿主體內(nèi)才能表達(dá)，屬于體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。
　　 5、構(gòu)建pilA基因