J亞型禽白血病JL-2株病毒的分離鑒定及gp85基因的克隆與表達(dá).pdf

1、J亞群禽白血病病毒(Avian leukosis virus Subgroup J,ALV-J)是20世紀(jì)80年代末在英國(guó)發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個(gè)禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)亞群,它主要引起肉雞的骨髓瘤白血病,給養(yǎng)禽業(yè)造成很大的損失.已知ALV-J的囊膜蛋白決定病毒的表型和病毒中和反應(yīng)類(lèi)型,其中由gp85基因編碼的病毒囊膜表面糖蛋白(Surface Subunit,SU)決定病毒的亞群.該實(shí)驗(yàn)采用ALV-J特

2、異性引物,用RT-PCR的方法從吉林省某種雞場(chǎng)送檢的種雞體內(nèi),檢出一株ALV-J病毒.遂將此ALV-J分離株命名為JL-2株.此株病毒通過(guò)CEF增殖后,提取宿主基因組作為PCR反應(yīng)的模板,根據(jù)GenBank中多株ALV-J病毒基因的完整序列,利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,擴(kuò)增出包括gp85基因在內(nèi)的大約1700bp核酸序列.將其插入克隆載體質(zhì)粒pMD18-T中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-JL-2/env,并對(duì)克隆的env

3、基因進(jìn)行序列測(cè)定.結(jié)果表明,所測(cè)序基因中g(shù)p85基因全長(zhǎng)924bp,編碼308個(gè)氨基酸,分子量為34 Ku.計(jì)算機(jī)輔助分析表明,與ALV-J原型株HPRS-103相比,JL-2株病毒除了在585到595位核苷酸處出現(xiàn)9個(gè)核苷酸的插入外,整段基因比較保守.其中JL-2株的gp85基因與HPRS-103的相應(yīng)部分的同源性為91.8﹪,氨基酸的同源性為86﹪.遺傳分析表明,JL-2病毒株極有可能起源于美國(guó)的Adol-hc-1病毒株.該實(shí)驗(yàn)根據(jù)

4、原核表達(dá)載體pGEX-6p-1的酶切圖譜,設(shè)計(jì)了另一對(duì)引物,用細(xì)胞培養(yǎng)物提取的基因組為模板,擴(kuò)增了前病毒gp85基因.將此段基因亞克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE<,3>),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)以后,表達(dá)出預(yù)計(jì)的60 Ku的融合蛋白,光密度掃描對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步定量表明,60 Ku融合蛋白占菌體總蛋白的31.8﹪.通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)原性分析,結(jié)果表明所得融合蛋白具有很好的抗原反應(yīng)特