B亞群禽白血病病毒單克隆抗體的制備.pdf

1、禽白血病是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的一大病毒性腫瘤病，由于其亞型較多，分布廣泛，且垂直傳播，因而，對此病的防制和凈化有一定難度。在我國的地方品系雞群中，禽白血病感染呈現(xiàn)較為嚴重的狀態(tài)。相關研究學者在過去一段時期內(nèi)對禽白血病研究偏向于致病性較強的J亞群病毒，而忽略了經(jīng)典的A/B亞群病毒，這間接的造成了本已存在于我國地方品系雞群中A/B亞群禽白血病病毒的泛濫。凈化地方品系雞群中A/B亞群禽白血病病毒，成為了當務之急，研制針對性的單克隆抗體，建立標準化

2、檢測試劑盒，實現(xiàn)對疾病快速而準確地監(jiān)控，是需首要完成的任務。
　　本實驗旨在制備針對B亞群禽白血病病毒的單克隆抗體。首先，利用IDEXX公司的AB亞群禽白血病病毒抗體檢測試劑盒對山東某地方壽光雞場雞群進行檢測，結果顯示抗體陽性率達70.37％(95/135)。剖檢病雞，觀察臟器病理變化，無菌采取表面有肉眼看見腫瘤結節(jié)的肝臟、脾臟等臟器，制備組織切片進行觀察。將病料凍存于超低溫冰箱，作為提取病毒和前病毒DNA的病料。
　　利用

3、病雞脾臟提取病毒液，并接種于DF-1細胞擴增病毒。用p27抗原檢測試劑盒檢測細胞上清，確定病毒存在，并命名為ALV-B-SG12，于超低溫冰箱凍存病毒液。采用寶生物公司DNAiso Reagent基因組DNA提取試劑處理病料，進行前病毒DNA的提取，以獲取目的基因。區(qū)分禽白血病病毒不同亞群的主要依據(jù)為gp85囊膜蛋白，不同亞群gp85基因序列的差異性決定了病毒囊膜蛋白的抗原特異性。針對ALV-B的gp85基因設計引物，進行擴增、回收和測

4、序。結果顯示1038bp測準。與國內(nèi)外報道的12株ALV-A同源率在85％左右，與6株ALV-B的同源率達90％以上，其中與RAV-2、WB11080、RSV-SCHMIDT-RUPPIN B以及JS-B1203四株的同源性高達96％以上。
　　將回收產(chǎn)物連接入pET32a載體，轉(zhuǎn)化進BL21大腸桿菌原核表達菌株，進行目的蛋白的表達。優(yōu)化表達條件，從IPTG濃度、溫度和時間三個方面進行試驗，對每次試驗進行SDS-PAGE檢測。最終

5、確定最適誘導表達條件為:IPTG濃度0.1 mmol/L、溫度30℃、誘導時間8h。超聲裂解菌液，過Ni柱純化后，進行SDS-PAGE檢測，在53kDa處有明顯條帶。用TGE透析液進行純化蛋白的復性，最終生產(chǎn)出可以作為特異性免疫原的活性蛋白。
　　在獲得純化蛋白后，首先建立間接ELISA檢測方法，通過一系列對比試驗確定最佳反應條件為抗原包被濃度3μg/ml、血清稀釋度為1∶1000、二抗的稀釋比例為1∶2000。于1、15、30d

6、免疫若干BALB/c小鼠，免疫量50μg純化蛋白每只每次，尾靜脈采集血液，分離血清，用建立好的方法進行檢測，顯示效價均高達1∶26～29。取三免后加強免一次的小鼠脾臟細胞與sp2/0細胞按3～5∶1進行細胞融合，前后共進行八次細胞融合工作，最終通過間接ELISA方法檢測出陽性孔。對陽性孔進行擴增和凍存，并取部分陽性孔細胞利用有限稀釋法進行亞克隆，篩選出單克隆的陽性細胞株。利用單克隆抗體進行IFA檢測，以及抗體分泌穩(wěn)定性試驗，可得所制備的