miR--125b和miR--221在J亞群禽白血病病毒感染過(guò)程中作用機(jī)制研究.pdf

1、J亞群禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由J亞群禽白血病病毒(subgroup J Avian Leukosis virus，ALV-J)感染引發(fā)的髓細(xì)胞瘤及多發(fā)性器官腫瘤的傳染病。ALV-J誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生不僅因?yàn)閬?lái)自病毒基因的整合、也受到宿主自身的調(diào)控。microRNAs(miRNAs)是一個(gè)22nt左右的非編碼RNA分子，其通過(guò)種子區(qū)與靶基因3'-UTR的結(jié)合，抑制靶基因的翻譯或降解其mRNA而負(fù)性調(diào)控靶分子。研究證明m

2、iRNAs分子對(duì)生命進(jìn)程的調(diào)控幾乎涉及到生命活動(dòng)各個(gè)方面，在細(xì)胞層面的調(diào)控包括周期、增殖、分化、凋亡等各個(gè)細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，ALV-J感染的雞腫瘤組織中，gga-miR-221和gga-miR-125b均顯著差異表達(dá)，而它們?cè)谌松弦呀?jīng)作為與腫瘤密切相關(guān)的致瘤因子而被廣泛研究。因此本項(xiàng)目以宿主miR-125b和miR-221分子為研究對(duì)象，從分子水平上揭示這兩個(gè)microRNAs分子在ALV-J致瘤過(guò)程中的可能作用機(jī)制

3、。
　　miR-125b分子與細(xì)胞生物進(jìn)程密切相關(guān)，為了研究其在ALV-J感染致瘤中可能的作用機(jī)制，首先通過(guò)生物信息學(xué)方法以及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選驗(yàn)證得到miR-125b的4個(gè)靶分子為KLF13，PAFAH1B1，PRDM1和Sema4D。然后通過(guò)STRING軟件對(duì)所得4個(gè)靶基因分別進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)KLF13，PAFAH1B1和PRDM1與細(xì)胞活性、細(xì)胞骨架或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等腫瘤生成過(guò)程相關(guān)，Sema4D具有促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)

4、胞骨架重組，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，血管生成等與腫瘤生成密切相關(guān)的作用。進(jìn)一步對(duì)Sema4D分子在ALV-J感染的組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ALV-J可以導(dǎo)致Sema4D的上調(diào)表達(dá)。對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的功能研究發(fā)現(xiàn)Sema4D具有抑制禽多種細(xì)胞凋亡作用。以上表明Sema4D分子可能作為致瘤基因而促進(jìn)雞體的腫瘤生成。
　　已有報(bào)道m(xù)iR-221在腫瘤生成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，為了揭示其在ALV-J導(dǎo)致的腫瘤中發(fā)揮的作用，首先通過(guò)生物信息學(xué)方法

5、以及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了miR-221的一個(gè)靶分子為CDKN1B。然后構(gòu)建了ALV-J感染的動(dòng)物模型以及體外DF1細(xì)胞病毒感染模型，通過(guò)相對(duì)熒光定量方法檢測(cè)ALV-J感染組織內(nèi)以及DF1細(xì)胞內(nèi)CDKN1B表達(dá)量與ALV-J感染的關(guān)系。結(jié)果表明ALV-J的感染在體內(nèi)體外均下調(diào)CDKN1B表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)miR-221及其靶基因CDKN1B功能研究發(fā)現(xiàn)ALV-J，miR-221和CDKN1B-siRNA-846具有促進(jìn)DF1細(xì)胞增殖活

6、性及G1/S周期轉(zhuǎn)化的作用。而miR-221抑制物和CDKN1B過(guò)表達(dá)具有與之相反的作用。ALV-J感染細(xì)胞的miR-221敲低實(shí)驗(yàn)和CDKN1B過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明miR-221抑制物和CDKN1B具有抑制ALV-J對(duì)細(xì)胞增殖和周期促進(jìn)的作用。以上均表明ALV-J在促進(jìn)腫瘤生成過(guò)程中通過(guò)miR-221抑制CDKN1B的作用而促進(jìn)腫瘤相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程。最后對(duì)細(xì)胞周期通路分析發(fā)現(xiàn)ALV-J對(duì)細(xì)胞周期和增殖活性的促進(jìn)作用實(shí)質(zhì)上是miR-221通

7、過(guò)抑制CDKN1B而釋放了CDKN1B-CDK2/CDK6通路中CDK2和CDK6的表達(dá)而發(fā)揮的促進(jìn)細(xì)胞周期作用。
　　本研究鑒定了miR-125b的4個(gè)與腫瘤生成相關(guān)的靶分子，其中Sema4D具有抑制禽多種細(xì)胞凋亡的功能，是一個(gè)潛在的致瘤基因，鑒定了miR-221的1個(gè)靶分子CDKN1B，以及在雞體內(nèi)ALV-J通過(guò)miR-221-CDKN1B-CDK2/CDK6通路促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度增殖的新的致瘤通路。本研究為ALV-J致病性的研究提