乙肝病毒基因突變與基因組多樣性和疾病關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、在我國(guó)，HBV慢性感染是導(dǎo)致肝硬化、肝癌發(fā)生的重要誘因。研究發(fā)現(xiàn)HBV的基因型可能與疾病的臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，而HBV基因的突變與肝炎的治療失敗和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此，通過(guò)對(duì)乙肝患者進(jìn)行HBV基因分型及腫瘤相關(guān)基因突變檢測(cè)，將有助于HBV感染相關(guān)肝病的個(gè)體化治療的指導(dǎo)和疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)警。在前期研究中，本課題組研發(fā)了包含HBV基因特異性擴(kuò)增、HBV基因分型軟件和HBV基因突變分析軟件的乙型病毒性肝炎個(gè)體化檢測(cè)平臺(tái)，應(yīng)用該平臺(tái)擴(kuò)增并分析乙肝

2、患者血清、組織樣本中HBV基因組序列，可以實(shí)現(xiàn)HBV基因分型和基因突變的分析，并已取得相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)。同時(shí)，在病例研究中我們發(fā)現(xiàn)了與基因型相關(guān)的特異性突變位點(diǎn)：RT區(qū)rt169和rt180位點(diǎn)和BCP區(qū)1799位點(diǎn)。然而在應(yīng)用該個(gè)體化檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行大樣本量檢測(cè)的過(guò)程中遇到了基因擴(kuò)增穩(wěn)定性不足、部分DNA序列難以解讀、軟件兼容性問(wèn)題等，因此本課題擬依據(jù)生物信息學(xué)原理優(yōu)化升級(jí)乙型病毒性肝炎個(gè)體化檢測(cè)平臺(tái)，探索DNA測(cè)序失敗的原因，并使用優(yōu)化的平

3、臺(tái)進(jìn)一步研究逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rt169、rt180位點(diǎn)和基本核心啟動(dòng)子區(qū)1799位點(diǎn)突變?cè)诟伟┌l(fā)生中的意義。
　　第一部分：乙型病毒性肝炎個(gè)體化檢測(cè)平臺(tái)優(yōu)化升級(jí)
　　目的：解決乙型病毒性肝炎個(gè)體化檢測(cè)平臺(tái)在大樣本量檢測(cè)過(guò)程中遇到的擴(kuò)增穩(wěn)定性不足和軟件兼容性問(wèn)題。
　　方法：采用生物信息學(xué)方法篩選符合中國(guó)地區(qū)HBV流行株特點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)序列，序列分析確定基因分型和基因型耐藥檢測(cè)的共用序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物。通過(guò)多序列比對(duì)確定型特異

4、性SNP位點(diǎn)，據(jù)此設(shè)計(jì)基因分型算法，將HBV基因分型和基因突變分析功能整合至新軟件中。使用新軟件和Genotyping tool軟件對(duì)GenBank收錄的中國(guó)人群感染的HBV的DNA序列進(jìn)行基因分型分析。
　　結(jié)果：分析獲得了HBV基因分型和基因型耐藥檢測(cè)功能共用序列，成功設(shè)計(jì)了相關(guān)基因擴(kuò)增引物；HBV基因分型和基因突變分析功能整合至新軟件HBVAnalyzer；HBVAnalyzer和Genotyping tool基因分型結(jié)果一

5、致。
　　第二部分：乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)突變分析
　　目的：了解HBV基因型與核苷（酸）類似物耐藥以及肝癌的關(guān)系，并探究rt169和rt180位點(diǎn)突變與肝癌發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：用優(yōu)化升級(jí)后的擴(kuò)增引物和乙型病毒性肝炎個(gè)體化檢測(cè)平臺(tái)對(duì)一組191例肝癌患者手術(shù)切除組織樣本進(jìn)行HBV RT區(qū)PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序、基因分型和基因型耐藥的檢測(cè)分析。
　　結(jié)果：從191例樣本中成功擴(kuò)增了190例HBV RT區(qū)片段，基因分型

6、結(jié)果顯示本研究中肝癌患者感染的HBV以C基因型為主（71.01％），B基因型次之（28.40%）。前期研究發(fā)現(xiàn)LC/HCC組 B基因型 HBV感染者rt169和 rt180位點(diǎn)存在較高比例的天然同義突變，本實(shí)驗(yàn)組HCC病人該位點(diǎn)突變率分別高達(dá)95.83%和100%。測(cè)序峰圖顯示rt169和rt180主要為雜合突變型（78.21%），與前期研究中LC/HCC組比較，兩組中雜合突變型比例相似；與前期研究中CHB組比較，雜合突變型比例顯著增加

7、（P＜0.01）。證明在疾病轉(zhuǎn)化過(guò)程中，B基因型HBV rt169和 rt180位點(diǎn)突變與病情發(fā)展具有相關(guān)性，可能成為預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的新的標(biāo)志物。
　　第三部分：乙肝病毒BCP/Pre C區(qū)基因序列常見突變與基因突變多樣性分析
　　目的：解析HBV BCP/Pre C區(qū)序列難以解讀的原因和解決辦法，揭示HBV BCP/Pre C區(qū)序列復(fù)雜突變與HBV基因組多樣性的關(guān)系，進(jìn)一步探究前期發(fā)現(xiàn)的HBV B型特異性新突變1799G>C

8、與肝癌的關(guān)系。
　　方法：采用構(gòu)建DNA文庫(kù)和單克隆測(cè)序的方法對(duì)直接測(cè)序失敗的21例病人樣本的HBVBCP/Pre C區(qū)序列進(jìn)行了深度測(cè)序分析；用優(yōu)化升級(jí)后的乙型病毒性肝炎個(gè)體化檢測(cè)平臺(tái)對(duì)病人肝癌組織樣本中HBVBCP/Pre C區(qū)序列進(jìn)行基因突變檢測(cè)分析。
　　結(jié)果：對(duì)21例PCR測(cè)序失敗的樣本進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)HCC病人感染的HBV病毒的BCP/Pre C區(qū)序列突變多達(dá)144種，包含20種缺失突變和7種插入突變

9、，其中△nt1757-1765和△nt1824-1832位點(diǎn)的高頻聯(lián)合缺失突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)；每一例樣本的突變至少包含6種，說(shuō)明HCC病人體內(nèi)HBV基因組BCP/Pre C區(qū)序列多樣性是是由基因組的復(fù)雜突變產(chǎn)生的，揭示了復(fù)雜突變是導(dǎo)致直接測(cè)序結(jié)果無(wú)法判讀的原因。
　　針對(duì)G1799C型特異性突變的研究顯示，本組HCC病人中B基因型者G1799C突變率為85.71%。與前期發(fā)現(xiàn)的結(jié)果吻合；進(jìn)一步分析顯示G1799C突變常與A1762T/