廣東地區(qū)乙肝病毒基因型及相關(guān)變異的調(diào)查研究.pdf

1、乙型肝炎病毒感染是一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，可引起慢性肝病及肝硬化、肝細胞癌的發(fā)生。我國是HBV感染的高地方流行地區(qū)，全國每年死于與HBV感染相關(guān)的肝病約30萬例。 為探討更適用于目前國內(nèi)臨床HBV-DNA定量檢測的血清標(biāo)本短期保存及運輸條件。選擇了HBV感染的4例住院患者新鮮血清，分別置于常溫(22-26℃)、4℃和-20℃保存，于第1天(Baseline)及采血后的第2、3、5、8天用熒光定量PCR法分別進行HBV-

2、DNA定量檢測。同時，對第1天和常溫保存第8天的血清標(biāo)本進行套式PCR擴增。結(jié)果血清標(biāo)本在采血后的8天時間里，3種溫度保存條件下，HBV-DNA定量檢測結(jié)果與Baseline比較均無顯著性差異(P＞0.05)。套式PCR均擴增出清晰的目的條帶。說明熒光定量PCR檢測HBV-DNA是相對敏感、穩(wěn)定的臨床檢測方法，血清標(biāo)本可以在常溫下短期保存和運輸后進行HBV-DNA定量檢測，這將更有利于推廣正規(guī)合理的乙肝防治方案。 根據(jù)全基因組異

3、質(zhì)性＞8％的原則，到目前為止，乙型肝炎病毒共分為A-H8個基因型。HBV基因型具有明確的地理分布特點和人種的特異性。A基因型主要流行于歐洲、非洲及北美地區(qū)；B型和C型主要流行于亞洲特別是東南亞地區(qū)；D型分布較廣，但主要流行于地中海及中東地區(qū)；E型僅見于西部非洲地區(qū)；F和G主要流行于中南美洲地區(qū)；H型為新鑒定的基因型，其分布情況有待進一步調(diào)查。不同的基因型又可進一步分為不同的亞型，A型分為A1(Aa)、A2(Ae)和A3(Ac)3個亞型，

4、A1和A3流行于非洲及亞洲地區(qū)，Ae流行于歐洲地區(qū)。B型主要分為Ba和Bj兩個亞型，Bj目前僅見于日本，而Ba流行于亞洲其他國家。C基因型目前發(fā)現(xiàn)了4個亞型，C1亞型主要流行于東南亞地區(qū)，如越南、泰國等國家，C2亞型主要見于東亞地區(qū)，包括日本、韓國等，C3在太平洋上的玻利尼西亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)，C4從澳洲當(dāng)?shù)氐耐林酥蟹蛛x得到。在我國流行的HBV基因型主要為B型和C型，其中北方以C型為主，南方以B型較常見。另外在我國西部的少數(shù)民族地區(qū)存在一定比

5、例的D基因型及C/D重組體。在我國流行的B基因型為Ba亞型，即病毒基因組的C區(qū)為C基因型特征，其余區(qū)段為B基因型特征。B基因亞型在我國具體流行情況如何?是否存在Bj亞型?另外，C基因亞型最近才被界定，其在我國的流行情況目前還不清楚。 為進一步調(diào)查廣東地區(qū)乙肝病毒基因型，特別是基因亞型的分布情況，我們應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法以及序列測定法，對全部來自廣東地區(qū)的417例慢性乙肝病毒感染者的血清進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在

6、全部的417份血清中，B基因型共有224份，占54％，C基因型共193份，占46％。隨機選取40例B基因型，并對其C基因區(qū)進行序列測定，結(jié)果證實，所有B基因型均為Ba亞型，未發(fā)現(xiàn)Bj亞型，說明Bj亞型在該地區(qū)極為罕見。這與國內(nèi)部分研究結(jié)果及國外研究結(jié)果相一致。國內(nèi)個別調(diào)查結(jié)果認為在我國有超過17％的B型感染者為Bj亞型，其結(jié)果與本研究結(jié)果不符，究其原因，是由于其在研究過程中所采用基因分型方法的局限性。本研究所調(diào)查的C基因型中有C1和C2

7、兩個亞型，其中C1亞型有122份，占全部C基因型的63％，C2亞型有71份，占所有C基因型的37％。據(jù)此我們認為，在廣東地區(qū)流行的乙肝病毒基因型主要為B型和C型，其中B型稍多于C型，B型均為Ba亞型，Bj亞型極為罕見。C基因型有兩個亞型，以C1亞型為主，C2亞型稍少。 關(guān)于HBV基因型與YMDD變異發(fā)生率的關(guān)系方面，目前雖有多個報導(dǎo)，但結(jié)果有所不同，有些研究結(jié)果認為基因型會影響YMDD變異的發(fā)生率，有的研究結(jié)果認為YMDD變異的

8、發(fā)生與基因型無關(guān)。與基因型B相比，基因型C感染者可能對拉米夫定治療后HBeAg的持續(xù)應(yīng)答偏低，但HBV基因型與拉米夫定耐藥突變株的選擇及臨床進展仍不清楚。另外，HBV前C區(qū)終止密碼(A83)變異與基因型有較強的相關(guān)性，基因型A少見而B、D、E及部分C與F型多見。我國流行的基因型主要為B和C基因型，而廣東地區(qū)流行的C基因型又可進一步分為C1和C2兩個亞型，那么A83變異在基因型C中的流行是否與亞型相關(guān)需要進一步研究。HBV基本核心啟動子(

9、BCP)區(qū)T1762/A1764變異與基因型的關(guān)系目前還不清楚。 為進一步探討基因型與YMDD變異的關(guān)系，特別是在我國占主要基因型的B型和C型，以及C基因亞型是否會對YMDD變異的發(fā)生產(chǎn)生影響；調(diào)查A83、BCP變異在B基因型及C1、C2亞型中的分布情況。用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法，對來源于廣東地區(qū)的640例經(jīng)拉米夫定治療的慢性HBV感染者血清進行了研究。結(jié)果在總共640份樣本中，共有211份樣本

10、經(jīng)RFLP鑒定為YMDD變異陽性，429份為YMDD變異陰性，YMDD變異陽性率為33.0％(211/640)。17例慢性無癥狀攜帶者中5例為YMDD變異陽性，占ASC組病人29.4％582例慢性乙型肝炎者中193例為YMDD變異陽性，占CHB組病人33.2％；37例肝硬化病人中，12例為YMDD變異陽性，占LC組病人32.4％；4例原發(fā)性肝癌病人中1例為YMDD變異陽性，占HCC組病人25％。各組病例YMDD變異的發(fā)率無統(tǒng)計學(xué)差異(P

11、＞0.05)。在554例男性患者中，186例為YMDD變異陽性，占男性組病人33.6％；86例女性患者中25例為YMDD變異陽性，占女性組病人29.1％。不同性別之間YMDD變異的發(fā)生也無顯著差異(P＞0.05)。 本研究中，在211份YMDD變異陽性血清中B基因型為107份，占YMDD陽性血清的50.7％，C基因型為104份，占YMDD陽性血清49.3％，與廣東地區(qū)總體基因型分布情況對比，YMDD變異組基因型分布無統(tǒng)計學(xué)差異(

12、P＞0.05)。104份YMDD變異陽性的C基因型中，C1亞型有67份，占C基因型64.4％，C2亞型37份，占C基因型35.6％。與第二部分結(jié)果相比，兩組間也無統(tǒng)計學(xué)差異。說明YMDD變異的發(fā)生與B、C基因型無關(guān)，也與C1、C2亞型無關(guān)。 在211份YMDD變異陽性血清中，63份為HBVA83變異陽性，占29.9％，148份為A83變異陰性，占70.1％。在107份B基因型中，41份為A83變異陽性，占38.3％；65份C1亞

13、型中，9份為A83變異陽性，占13.8％；39份C2亞型中，13份為A83變異陽性，占33.3％。A83變異在基因型B中的分布最高，C2亞型中的分布次之，C1亞型中的分布最低，變異在不同基因型中的分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.03)。 在211份YMDD變異陽性血清中，74份為HBVBCP變異陽性，占35.1％，137份為BCP變異陰性，占64.9％。在107份B基因型中，23份為BCP變異陽性，占21.5％；65份C1亞型中，34

14、份為BCP變異陽性，占52.3％；39份C2亞型中，17份為BCP變異陽性，占43.6％。BCP變異在基因型C1亞型中的分布最高，C2亞型中的分布次之，B中的分布最低，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，BCP變異在不同基因型中的分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。 在本研究中，前C區(qū)A83變異的發(fā)生率B基因型最高，C2亞型次之，C1亞型最低，而且三者之間變異的發(fā)生率有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，說明基因型B及C2亞型1858位的T的確會對A83變異產(chǎn)生明顯影

15、響，而C1亞型也有一定的變異率，一方面提示并非所有C1亞型的1858位核苷酸都為C；另一方面也提示，A83變異可能還受其它因素的影響。在BCP變異方面，與A83在三種不同基因型中差別剛好相反，BCP變異的發(fā)生率C1基因型最高，C2亞型次之，B亞型最低，差別有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。由于這兩種變異都會影響HBeAg的產(chǎn)生，A83變異后使HBeAg的翻譯過程提前終止，因此血清中檢測不到HBeAg；而BCP變異會影響前C基因啟動子區(qū)核苷酸與轉(zhuǎn)錄因子