2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、人硫酸酯酶1(humansulfatase1,hSulf-1)是一個(gè)細(xì)胞生長的負(fù)向調(diào)控因子,在人體正常組織中恒定表達(dá),而在絕大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中(如乳腺癌、胰腺癌、腎臟癌、肝細(xì)胞癌等)表達(dá)水平下調(diào)。已有研究證明,腫瘤細(xì)胞中hSulf-1基因的再表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力有所減弱,同時(shí)促進(jìn)藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡,抑制腫瘤發(fā)生和血管形成。hSulf-1基因編碼一種芳基硫酸酯酶,在細(xì)胞外間質(zhì)中降低硫酸肝素糖胺聚糖的硫酸化程

2、度,進(jìn)而影響與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)密切相關(guān)的多種胞外信號(hào)分子與其相應(yīng)受體結(jié)合的過程,從而改變多種信號(hào)通路的活性。本研究旨在通過構(gòu)建的腺病毒載體將目的基因hSulf-1運(yùn)送到血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中,在體內(nèi)外研究hSulf-1蛋白對(duì)于細(xì)胞增殖與遷移能力的影響,為臨床上腫瘤的基因治療提供了新的分子靶標(biāo)。
   第一部分,hSulf-1基因腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
   [目的]:克隆人硫酸酯酶1(hSulf-1)基因

3、并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的腺病毒載體Ad5-hSulf1;
   [方法]:采用PCR方法從pcDNA3.1-hSulf1質(zhì)粒中擴(kuò)增hSulf-1基因,插入到腺病毒質(zhì)粒載體pDC315的多克隆位點(diǎn)區(qū),構(gòu)建pDC315-hSulf1。利用轉(zhuǎn)染試劑,將pDC315-hSulf1與腺病毒包裝質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中,得到重組腺病毒Ad5-hSulf1。PCR鑒定同時(shí)進(jìn)行DNA測序,鑒定正確后,大量擴(kuò)增并純化。同樣的方法構(gòu)建攜帶增強(qiáng)型綠色熒

4、光蛋白基因(EGFP)的對(duì)照腺病毒Ad5-EGFP。TCID50法測定病毒滴度。
   [結(jié)果]:PCR鑒定和測序結(jié)果都證實(shí),hSulf-1基因腺病毒表達(dá)載體Ad5-hSulf1構(gòu)建成功。TCID50法測病毒滴度,Ad5-hSulf1為1.15×1010pfu/mL(plaqueformingunit/mL),對(duì)照病毒Ad5-EGFP滴度為1.80×108pfu/mL。
   [結(jié)論]:成功構(gòu)建了hSulf-1基因腺病毒

5、表達(dá)載體Ad5-hSulf1,為進(jìn)一步體內(nèi)外研究奠定了基礎(chǔ)。
   第二部分,hSulf-1基因的過表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移能力的影響
   [目的]:研究hSulf-1基因的過表達(dá)對(duì)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304增殖、遷移能力的影響。
   [方法]:應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測hSulf-1基因在ECV-304細(xì)胞中的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt、ERK的表達(dá)變化;MTT實(shí)驗(yàn)檢測hSulf-1過表達(dá)對(duì)于ECV-3

6、04細(xì)胞增殖的影響;采用劃痕實(shí)驗(yàn)研究hSulf-1過表達(dá)對(duì)于ECV-304細(xì)胞遷移的影響。
   [結(jié)果]:免疫印跡結(jié)果表明hSulf-1基因過表達(dá)會(huì)下調(diào)ECV-304細(xì)胞Akt和ERK信號(hào)分子的磷酸化水平;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hSulf-1基因過表達(dá)抑制了ECV-304細(xì)胞增殖,感染復(fù)數(shù)為50,100時(shí)細(xì)胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hSulf-1基因過表達(dá)能夠抑制細(xì)胞

7、的遷移,實(shí)驗(yàn)組相比于對(duì)照組,細(xì)胞遷移能力明顯減弱(P<0.01)。
   [結(jié)論]:重組腺病毒Ad5-hSulf1介導(dǎo)的hSulf-1基因在ECV-304細(xì)胞中的過表達(dá)明顯抑制細(xì)胞增殖及遷移,為hSulf-1用于腫瘤及血管生長相關(guān)疾病的基因治療奠定了基礎(chǔ)。
   第三部分,hSulf-1基因通過下調(diào)VEGFR2信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)研究
   [目的]:通過體外實(shí)驗(yàn)研究hSulf-1基因如何通過影響VE

8、GFR2信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
   [方法]:通過對(duì)不同腫瘤組織標(biāo)本免疫組化檢測hSulf-1基因的表達(dá)情況;Westernblotting檢測肝癌、卵巢癌細(xì)胞中導(dǎo)入hSulf-1基因以及干擾hSulf-1基因后VEGFR2的表達(dá)變化;MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測hSulf-1基因的表達(dá),VEGFR2的沉默以及兩者聯(lián)合對(duì)于肝癌、卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。
   [結(jié)果]:在肝癌,乳腺癌,胃癌,腎癌,和結(jié)腸癌樣本的免疫組化結(jié)果顯示h

9、Sulf-1基因的陽性表達(dá)率分別為23.1%、16.7%、31.8%、11.1%、44.4%,相比于hSulf-1陰性的肝癌,hSulf-1陽性的肝癌組織樣本p-VEGFR2Tyr1175的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05),而t-VEGFR2的表達(dá)水平無明顯區(qū)別(P>0.05);Westernblotting結(jié)果顯示肝癌、卵巢癌細(xì)胞中成功導(dǎo)入hSulf-1基因后p-VEGFR2Tyr1175的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05),干擾hSu

10、lf-1表達(dá)后p-VEGFR2Tyrl175的表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hSulf-1基因的表達(dá),VEGFR2的沉默都會(huì)導(dǎo)致肝癌、卵巢癌細(xì)胞存活率下降,兩者聯(lián)合后腫瘤細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低。
   [結(jié)論]:在大多數(shù)人類腫瘤中,hSulf-1基因失活是一個(gè)普遍的現(xiàn)象;在肝癌和卵巢癌細(xì)胞中,hSulf-1基因的表達(dá)會(huì)下凋p_VEGFR2Tyr1175的表達(dá)水平,腫瘤細(xì)胞增殖能力減弱。
   第四部分,裸鼠腫瘤

11、模型的建立及研究hSulf-1基因的表達(dá)對(duì)瘤內(nèi)血管密度和腫瘤生長的影響
   [目的]:建立小鼠腫瘤模型,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究hSulf-1基因的表達(dá)對(duì)于小鼠腫瘤生長以及瘤內(nèi)血管生長的影響。
   [方法]:建立小鼠肝癌、卵巢癌移植瘤模型,給予hSulf-1基因治療,觀察移植瘤的生長情況,免疫組化及Westernblotting驗(yàn)證hSulf-1對(duì)移植瘤血管密度及信號(hào)通路的影響;
   [結(jié)果]:成功建立小鼠肝癌、卵

12、巢癌移植瘤模型,兩個(gè)模型中都表現(xiàn)為Ad5-hSulf1組腫瘤生長抑制最為明顯,與空白對(duì)照組相比,卵巢癌模型組抑制率為46.19%,肝癌模型組抑制率為49.56%(P<0.01);而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間無明顯差別(P>0.05)。剝離卵巢癌移植瘤瘤體,Ad5-hSulf1組瘤體的質(zhì)量相比于另外兩組明顯小(P<0.01);CD31免疫組化結(jié)果顯示,Ad5-hSulf1組和對(duì)照組的血管密度分別為24.67±6.51和2.33±12.34

13、,二者差異明顯(P<0.05);Westernblot和免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Ad5-hSulf1組中p-VEGFR2Tyr1175和p-AKTThr308表達(dá)均下調(diào)。
   [結(jié)論]:以裸鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別建立卵巢癌SKOV3細(xì)胞成瘤模型和肝癌BEL-7404細(xì)胞成瘤模型。用腺病毒Ad5-hSulf1對(duì)其進(jìn)行治療,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。結(jié)果顯示Ad5-hSulf1治療后腫瘤生長受阻,p-VEGFR2Tyr1175和p-AKT

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