表達(dá)Anhinga株HN基因嵌合病毒的構(gòu)建及其抗腫瘤效果的研究.pdf

1、新城疫病毒(NDV)為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，屬副粘病毒科、禽副粘病毒屬。19世紀(jì)20年代，有研究報道NDV能殺傷腫瘤細(xì)胞，1964年，NDV首次被用于癌癥的治療，從此NDV作為一種潛在的腫瘤治療生物制劑引起了人們的關(guān)注，成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。根據(jù)該病毒對易感動物雞的致病力將NDV分為強(qiáng)毒株、中毒株和弱毒株。強(qiáng)毒株溶瘤效果好，但對生態(tài)造成威脅，影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展;弱毒株對生物環(huán)境友好，對家禽沒有致病作用，但溶瘤效果較差。選擇什

2、么樣的毒株作為腫瘤治療制劑一直是該研究領(lǐng)域難以決定的重大問題。最理想的選擇是提高弱毒株的溶瘤效果，而不改變病毒的毒力。以往的研究表明NDV的F基因是決定病毒溶瘤效果的關(guān)鍵基因，但是F基因的溶瘤效果與病毒的毒力密切相關(guān)。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，當(dāng)使用強(qiáng)毒株的F基因替換弱毒株的F基因時，NDV溶瘤活性增加，但是同時受體病毒的毒力大幅度提高，甚至可以達(dá)到強(qiáng)毒株的毒力。這些結(jié)果排除了用F基因提高弱毒株溶瘤效果的可能性。
　　最近美國東南禽病研究

3、所Qingzhong Yu團(tuán)隊(duì)報道了NDV Anhinga毒株的HN基因的突變顯著提高了該病毒形成合胞體的能力，說明除F基因外，HN基因可能也是決定病毒溶瘤效果的重要因素。NDV的HN蛋白是一個多功能蛋白，其在病毒的感染過程中扮演著十分重要的角色。HN蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種活性，可以識別細(xì)胞表面的唾液酸受體從而促進(jìn)F蛋白的融合作用。但是，HN基因引起溶瘤效果與病毒致病力的關(guān)系還未見報道。本研究旨在用中毒Anhinga的HN基因替

4、換弱毒株Clone30的HN基因，觀察是否能提高弱毒株的溶瘤效果、如能提高弱毒株的溶瘤效果，是否增加弱毒株的對易感動物的致病力，為研制安全、有效（即提高NDV的溶瘤效果，而保持弱毒株的安全性）的溶瘤病毒制劑奠定理論基礎(chǔ)。
　　為了在DNA水平置換中毒株Anhinga的HN基因，本研究首先應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù)克隆弱毒株Clone30的全長基因組。采取了“分段克隆”的策略。在構(gòu)建cDNA克隆時，將NDV Clone30全基因組分成部分

5、重疊的十個片段，利用重疊部分的酶切位點(diǎn)將這十個片段依次克隆到低拷貝質(zhì)粒PFLC中，并在基因組3523bp、12357bp位置上進(jìn)行定點(diǎn)突變，作為分子標(biāo)簽用于鑒定拯救出的病毒。本實(shí)驗(yàn)采取的是不依賴于輔助病毒的完全質(zhì)粒操作系統(tǒng)，并使用穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的BHK-21細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。拯救獲得的重組病毒通過雞胚進(jìn)行增殖并收集尿囊液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，重組病毒命名為新城疫rClone30。然后用中毒株Anhinga(Anh)的HN基因替換了弱毒株Cl

6、one30的HN基因，構(gòu)建了重組嵌合病毒rClone30-Anh(HN)。首先將HN基因的PCR產(chǎn)物亞克隆入感染性克隆pClone30載體，與輔助質(zhì)粒NP、P和L共同轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，37℃培養(yǎng)72h后，于-80℃凍融三次收取細(xì)胞上清，接種9-11日齡的SPF雞胚。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，收獲得雞胚尿囊液，即為嵌合病毒rClone30-Anh(HN)。
　　對嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的生物學(xué)特性分析顯示，嵌合病毒和親

7、本毒株具有相同的生長動力學(xué)曲線，即HN基因的替換并沒有影響Clone30的復(fù)制。嵌合病毒的HA效價(24)低于親本毒株Clone30(29)與供體株Anh相似(24)。同時，與親本毒株相比嵌合病毒在引起細(xì)胞融合的能力上明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)在嵌合病毒感染的HepG2細(xì)胞單層中產(chǎn)生較大的合胞體。對嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的毒力和致病力分析顯示，rClone30-Anh(HN)與親本毒株在半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50=3.95×

8、107)、平均死亡時間(MDT＞120h)和雞胚半數(shù)感染量(EID50=1.8×108)上沒有顯著區(qū)別。嵌合病毒腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為0.08略高于親本毒株(ICPI=0)，但仍屬于弱毒株(ICPI=0-0.5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HN基因的替換沒有對Clone30毒力和致病力造成明顯的影響。在細(xì)胞水平上，對嵌合病毒rClone30-Anh(HN)抑制腫瘤能力進(jìn)行分析。MTT結(jié)果顯示與親本毒株相比，rClone30-Anh(HN)表現(xiàn)出對

9、人肝癌細(xì)胞HepG2更為顯著的細(xì)胞毒性作用。通過對兩種病毒感染的HepG2細(xì)胞進(jìn)行AnnexinⅤ-PI檢測、Rhodamine123染色和Caspase3基因轉(zhuǎn)錄水平分析，結(jié)果表明HN基因的替換顯著提高了嵌合病毒rClone30-Anh(HN)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。利用兩種病毒對鼠源肝癌H22荷瘤小鼠進(jìn)行治療，結(jié)果表明與親本毒株相比rClone30-Anh(HN)治療組的小鼠腫瘤體積明顯縮小，腫瘤病理切片顯示該治療組的腫瘤內(nèi)出現(xiàn)了較

10、為嚴(yán)重的T細(xì)胞浸潤和壞死。實(shí)驗(yàn)證明HN基因的替換提高了Clone30株在體內(nèi)的抑瘤效果。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建了表達(dá)中毒株Anhinga的HN基因的重組弱毒株Clone30嵌合病毒rClone30-Anh(HN)。該嵌合病毒在毒力和致病性與親本毒株相似，但顯著提高了嵌合病毒的抑瘤活性。這些結(jié)果為研制溶瘤效果好，致病力低，安全有效的溶瘤病毒提供了一個嶄新的思路。同時得到的嵌合病毒rClone30-Anh(HN)有望取代親本病毒C