基因重組腫瘤相關抗原MAGE-1的表達及其抗腫瘤研究.pdf

1、研究背景及目的；黑色素瘤抗原基因家族(MAGEgenefamily)主要包括四個亞家族：MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C和MAGE-D，它們分別位于X染色體的Xq28，Xp21.3，Xq26和Xp11。其中MAGE-A又包含12個基因，從MAGE-1至MAGE-12。MAGE-1基因位于X染色體長臂末端，基因片段長4.5kb，含有3個外顯子，其轉錄的mRNA全長1722bp。MAGE-1編碼的腫瘤相關抗原MZ2-E為單鏈的多肽，

2、包含309個氨基酸殘基。近年來，國內外大量文獻報道，MAGE-1基因在肝癌、食管癌、胃癌、舌癌、白血病、頭頸癌、肺癌、骨肉瘤、膀胱癌、卵巢癌、睪丸癌、神經母細胞瘤等常見腫瘤中都有較高的表達率，而在正常組織、炎癥組織及良性腫瘤組織中無該類基因的表達。迄今為止，已發(fā)現8個由MAGE-1基因編碼的HLA-Ⅰ類分子限制的CTL表位。因此，利用MAGE-1抗原作為腫瘤疫苗用于腫瘤病人的特異性免疫治療具有廣闊的前景。 本研究利用分子生物學技

3、術，克隆并在體外高效表達MAGE-1基因。構建MAGE-1基因疫苗，并在細胞水平和動物個體水平進行抗腫瘤生物活性方面的研究。為腫瘤的輔助ELISA檢測、腫瘤的生物學治療和瘤苗的研制奠定基礎。 材料和方法 從人肝細胞性肝癌(HCC)組織中提取總RNA，通過RT-PCR擴增出MAGE-1基因，酶切鑒定后。將其插入pGEM-TEasy載體，對其進行序列測定并與GenBank已知序列進行同源性分析。再將其克隆至原核表達載體pGE

4、X-4T-1和真核表達載體pcDNA3.1(+)，并分別在大腸桿菌BL21(DE3)和人肝癌細胞株SMMC-7721進行表達。取健康人外周血，分離樹突狀細胞和T淋巴細胞。用脂質體介導的方法分別用質粒pcDNA3.1-MAGE-1和pcDNA3.1轉染SMMC-7721細胞。再分別用轉染pcDNA3.1-MAGE-1的SMMC-7721細胞、轉染pcDNA3.1的SMMC-7721細胞和未轉染的野生型SMMC-7721細胞的凍融抗原攻擊樹

5、突狀細胞，使其激活T淋巴細胞成為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測CTL對野生型SMMC-7721細胞的殺傷活性。用真核表達重組子pcDNA3.1-MAGE-1預先免疫C57小鼠，以空質粒pcDNA3.1和PBS為對照，每隔10天一次，共3次。末次免疫后第5天用免疫細胞化學的方法檢測小鼠血清中MAGE-1抗體，ELISA檢測脾細胞培養(yǎng)液中IL-2和IFN-γ的含量。第6天給小鼠接種鼠源肝癌細胞H22，觀察其成瘤

6、期及生存期。 結果；1.從人肝細胞性肝癌(HCC)組織中擴增并克隆的MAGE-1基因與GenBank中已報道的MAGE-1基因序列相比較，僅有4個堿基存在差異，分別是：719位A→G，835位C→T，847位G→A，1438位C→T。其余完全相同，同源性為99.7％。其中，只有719位A→G導致第32位氨基酸的改變：蘇氨酸→丙氨酸(Thr→Ala)，其余堿基改變均未引起氨基酸的改變。而且，第32位氨基酸的改變并不引起整個蛋白質二

7、級結構的改變。 2.PCR及測序結果顯示，克隆入原核表達載體pGEX-4T-1的基因序列與從HCC中擴增并克隆的MAGE-1基因一致，是MAGE-1基因。 3.經1mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導4h，MAGE-1基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達即達高峰,SDS-PAGE及凝膠密度掃描分析表明，目的蛋白約57kD,占菌體總蛋白的23％。 4.PCR及測序結果顯示，克隆入真核表達載體p

8、cDNA3.1的基因序列與從HCC中擴增并克隆的MAGE-1基因一致，是MAGE-1基因。 5.將真核表達重組子pcDNA3.1-MAGE-1轉染人肝癌細胞SMMC-7721后，SMMC-7721細胞的MAGE-1基因表達量顯著增高。 6.轉染pcDNA3.1-MAGE-1質粒的SMMC-7721細胞、轉染pcDNA3.1質粒的SMMC-7721細胞和未轉染的野生型SMMC-7721細胞的凍融抗原所激活的CTL對野生型S

9、MMC-7721細胞的殺傷活性無顯著性差異(P＞0.05)。 7.接種pcDNA3.1-MAGE-1的小鼠血清中均產生了MAGE-1抗體，而pcDNA3.1組和PBS組小鼠均沒有產生MAGE-1抗體。 8.接種pcDNA3.1-MAGE-1的小鼠脾細胞培養(yǎng)液中IL-2的含量為108.67±12.81pg/ml，IFN-γ的含量為：372.33±10.08pg/ml。而pcDNA3.1組和PBS組小鼠脾細胞培養(yǎng)液中IL-2

10、和IFN-γ的含量幾乎為0。 9.接種pcDNA3.1-MAGE-1的小鼠在接種腫瘤后生存期為17.36±1.598天，pcDNA3.1組生存期為13.13±1.727天，PBS組生存期為12±1.069天。pcDNA3.1-MAGE-1組與其他兩組存在顯著性差異(P＜0.01)。 結論；1.成功克隆MAGE-1基因，發(fā)現其具有基因多態(tài)性，但所表達的蛋白二級結構一致； 2.成功構建原核表達重組子pGEX-4T-1