MAGE-4和MAGE-12基因克隆、表達(dá)及腫瘤臨床應(yīng)用前景研究.pdf

1、目的：MAGE是腫瘤特異性抗原CT抗原中的一大家族，它的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的主動免疫治療開創(chuàng)了一個新的紀(jì)元。多肽疫苗由于特異性強(qiáng)、副作用小、易于控制一直是腫瘤疫苗研究的熱點(diǎn)，而MAGE家族因其在多種腫瘤細(xì)胞的特異性表達(dá)及在多種組織類型腫瘤細(xì)胞的廣泛性表達(dá)成為多肽疫苗研究的首選。為此本實(shí)驗(yàn)克隆MAGE-4和MAGE-12用于制備單克隆抗體及多表位腫瘤多肽疫苗。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：從A375細(xì)胞和K562細(xì)胞中分別擴(kuò)增得到MAGE-4和MAGE-1

2、2的全長cDNA并檢測了MAGE-4、MAGE-12和NY-ESO-1在腫瘤細(xì)胞系和食管癌及肺癌組織中的表達(dá)，構(gòu)建GST-MAGE-4原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)MAGE-4蛋白，WesternBlot鑒定蛋白并且通過BCA對蛋白定量。生物學(xué)軟件進(jìn)行抗原肽的理論預(yù)測和分析，為多克隆抗體、單克隆抗體及腫瘤多肽疫苗的制備創(chuàng)造條件。 實(shí)驗(yàn)方法：RT-PCR從A375細(xì)胞和K562細(xì)胞中分別擴(kuò)增得到MAGE-4和MAGE-12的全長c

3、DNA，利用半定量RT-PCR檢測了MAGE-4、MAGE-12和NY-ESO-1在腫瘤細(xì)胞系和食管癌及肺癌組織中mRNA水平的表達(dá)。，純化的蛋白經(jīng)WesternBlot檢測和BCA定量。用BIMAS和SYFPEITHE軟件進(jìn)行抗原肽的理論預(yù)測和分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、RT-PCR獲得MAGE-4和MAGE-12的全長cDNA分別為1022bp和1322bp。2、MAGE-4在卵巢癌細(xì)胞OVCAR3中不表達(dá)，食管癌中表達(dá)達(dá)60％(

4、18/30)，肺癌中表達(dá)達(dá)30％(8/28)。MAGE-12在卵巢癌細(xì)胞系OC3、OVCAR3中不表達(dá)，食管癌中表達(dá)達(dá)70％(21/30)，肺癌中表達(dá)達(dá)36％(10/28)。3、成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-2-MAGE-4，0.1mMIPTG30℃條件下誘導(dǎo)3小時為理想的誘導(dǎo)的條件，SDS-PAGE電泳和Westernblot結(jié)果證明所獲蛋白為目的蛋白。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：1、原核表達(dá)載體pGEX-4T-2-MAGE-4可以高效