黑素瘤MAGe-A1基因以及EMT相關(guān)miRNA功能研究.pdf

1、MAGE-A1基因(Melanoma Associated Antigen Family A1)是一種癌癥生殖(cancer-germline，CG)基因或者腫瘤睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)基因，染色質(zhì)定位于人類X染色體q28區(qū)域，近年來發(fā)現(xiàn)MAGE-A1基因在多種腫瘤中，包括黑素瘤中表達(dá)增高。本研究通過之前研究發(fā)現(xiàn)，從色素痣、原位黑素瘤到轉(zhuǎn)移黑素瘤MAGE-A1基因表達(dá)逐步增高。
　　miRNA

2、是存在真核生物體內(nèi)的內(nèi)源性小分子RNA，長度約22bp左右，miRNA通過與靶基因結(jié)合形成二聚體，可導(dǎo)致靶基因的降解或者抑制其翻譯，達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在黑素瘤EMT過程中，多個(gè)重要調(diào)節(jié)基因可以被多個(gè)miRNA調(diào)控。本研究結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄組和miRNA組數(shù)據(jù)，分析對(duì)黑素瘤EMT過程有重要調(diào)控作用的miRNA。
　　目的：
　　1.確定MAGE-A1基因在黑素瘤惡化和轉(zhuǎn)移過程中的作用，研究其分子調(diào)控機(jī)制。<

3、br>　　2.篩選出對(duì)黑素瘤EMT過程有重要調(diào)控作用的miRNA，驗(yàn)證其細(xì)胞生物學(xué)功能和參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　方法：
　　一、MAGE-A1基因過表達(dá)及敲低對(duì)黑素瘤細(xì)胞功能的影響及其作用機(jī)制分析
　　1.qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞系及黑素瘤患者樣本中MAGE-A1基因的表達(dá)。2.在A375，A2058細(xì)胞構(gòu)建過表達(dá)和敲低MAGE-A1基因細(xì)胞系。3.應(yīng)用克隆形成，細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)和敲低MAGE-A1基因?qū)?/p>

4、素瘤細(xì)胞增殖能力的影響。4.Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)和敲低MAGE-A1基因?qū)谒亓黾?xì)胞侵襲和遷移能力的影響。5.通過RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究A375細(xì)胞中過表達(dá)和敲低MAGE-A1基因?qū)?xì)胞基因表達(dá)的影響，運(yùn)用GO和IPA等生物信息學(xué)軟件分析其影響的細(xì)胞功能并構(gòu)建相應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　二、miRNA調(diào)控黑素瘤EMT過程的分子網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制
　　1.結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄組和miRNA組數(shù)據(jù)，應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩

5、選對(duì)黑素瘤EMT過程有調(diào)控作用的miRNA。2.qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞系中miRNA的真實(shí)表達(dá)情況。3.通過transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察A375細(xì)胞過表達(dá)miRNA對(duì)黑素瘤遷移能力的影響。4.運(yùn)用IPA等軟件分析在黑素瘤EMT過程中miRNA靶基因參與的細(xì)胞功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。5.qRT-PCR分析過表達(dá)miRNA細(xì)胞系中EMT相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　一、MAGE-A1基因過表達(dá)及敲低對(duì)黑素瘤細(xì)胞功能的影響及

6、其作用機(jī)制分析
　　1.相比色素痣，黑素瘤細(xì)胞系和患者組織樣本中MAGE-A1基因的表達(dá)水平升高，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。2.在黑素瘤A375和A2058細(xì)胞系，過表達(dá)MAGE-A1基因能明顯增強(qiáng)黑素瘤的克隆形成和細(xì)胞增值能力，反之敲低MAGE-A1基因?qū)е孪陆?，?xì)胞周期測(cè)定與上述結(jié)果一致(P＜0.05)。3.黑素瘤中過表達(dá)MAGE-A1基因，其侵襲和遷移能力增強(qiáng)，而敲低則導(dǎo)致降低(P＜0.05)。4.RNA-s

7、eq分析發(fā)現(xiàn)，MAGE-A1基因通過對(duì)MAPK-ERK，PI3K-AKT，NF-κB，Hedgehog和Wnt信號(hào)通路的調(diào)控影響黑素瘤的EMT過程。
　　二、miRNA調(diào)控黑素瘤EMT過程的分子網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制
　　1.通過Mirbase等軟件預(yù)測(cè)出11個(gè)miRNA和48個(gè)對(duì)應(yīng)的靶基因。2.在3個(gè)細(xì)胞系中，經(jīng)過qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)7個(gè)miRNA與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。3.黑素瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除miR-195-5p外，其它6個(gè)m

8、iRNA過表達(dá)對(duì)黑素瘤的遷移能力有明顯的影響。4.在7個(gè)過表達(dá)miRNA細(xì)胞系，對(duì)EMT相關(guān)重要基因進(jìn)行mRNA水平驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)mir-195-5p，mir-130a-3p，mir-509-5p和mir-509-3-5p這4個(gè)miRNA對(duì)黑素瘤EMT過程具有重要影響。5.通過11個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的48個(gè)靶基因構(gòu)建分子調(diào)節(jié)通路發(fā)現(xiàn)，11個(gè)miRNA參與了多個(gè)腫瘤EMT相關(guān)的通路調(diào)節(jié)。
　　結(jié)論：
　　1 MAGE-A1基因通過MA

9、PK-ERK、PI3K-AKT、NF-κB、Hedgehog和Wnt等多個(gè)信號(hào)通路參與黑素瘤的EMT過程，并對(duì)黑素瘤細(xì)胞的克隆形成，細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力產(chǎn)生影響。
　　2.生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)11個(gè)miRNA通過干預(yù)Wnt、VEGF、NF-κB、PTEN、PI3K-AKT等信號(hào)通路途徑;以及對(duì)TP53、c-MYC和MMP9等重要基因的促進(jìn)或者抑制作用，調(diào)控黑素瘤的EMT過程。通過體外transwell小室等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其中6個(gè)