蘆筍皂苷合成相關(guān)基因分離與表達(dá)研究以及miRNA全基因組分析.pdf

1、蘆筍(Asparagus officinalis L.)俗稱石刁柏、龍須菜，系百合科天門冬屬雌雄異株宿根性多年生草本植物。蘆筍中含有游離氨基酸、維生素、微量元素硒等多種營(yíng)養(yǎng)成分，以及甾體皂苷、多糖、黃酮類等藥用成分，具有極高的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:蘆筍提取物對(duì)多種癌細(xì)胞均有抑制作用，具有降血脂、提高人體免疫功能、抗衰老等功能，其中，甾體皂苷為重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。但目前對(duì)于蘆筍甾體皂苷的生物合成過程研究涉及很少。本研究在分析蘆筍

2、中總皂苷含量的時(shí)空分布特征基礎(chǔ)上，利用RT-PCR與RACE-PCR技術(shù)分離了蘆筍皂苷合成關(guān)鍵基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)蘆筍不同器官及蘆筍嫩莖不同發(fā)育時(shí)期各個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，旨在探明蘆筍皂苷合成與積累調(diào)控的分子基礎(chǔ)。近年來，在小分子RNA中發(fā)現(xiàn)了一類與調(diào)節(jié)基因表達(dá)密切相關(guān)的分子microRNA，其在多種生物學(xué)進(jìn)程中具有重要的調(diào)控作用，包括生長(zhǎng)、代謝過程以及生物或非生物脅迫反應(yīng)等。本論文以雌雄蘆筍植株為材

3、料，構(gòu)建了兩個(gè)sRNA文庫，利用高通量測(cè)序?yàn)檠芯渴侄?，旨在從miRNA水平上分析蘆筍雌雄株之間的差異，從而找出引起蘆筍雌雄分化及維持兩者生物學(xué)特征的miRNA，為研究蘆筍的性別分化提供一定的理論基礎(chǔ)。而蘆筍作為植物性別分化開始的模式植物，對(duì)其的研究也為探明植物界性別分化提供一定的理論依據(jù)。
　　本研究主要研究成果:
　　(1)通過同源克隆技術(shù)及RACE技術(shù)，分離了蘆筍皂苷生物合成過程的關(guān)鍵酶法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)、鯊

4、烯合成酶(SQS)、鯊烯環(huán)氧化酶(SE)、環(huán)阿屯醇合成酶(CAS)等基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)這些基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。AoFPPS基因的全長(zhǎng)1405 bp，其中最大ORF為1050 bp，編碼350個(gè)氨基酸，其5'-UTR長(zhǎng)度為54 bp，3'-UTR長(zhǎng)度為301bp; AoSQS全長(zhǎng)為1799 bp，包含88 bp的5'-UTR、481 bp的3'-UTR和1230的ORF，編碼409個(gè)氨基酸。AoSE基因的全長(zhǎng)為1909 b

5、p，其中最大ORF長(zhǎng)度為1581 bp，編碼527個(gè)氨基酸，5'-UTR長(zhǎng)度為75 bp，3'-UTR長(zhǎng)度為253 bp。AoCAS基因的全長(zhǎng)為2556 bp，其中ORF長(zhǎng)度為2283 bp，編碼760個(gè)氨基酸，克隆到的5'-UTR長(zhǎng)度為79bp，3'-UTR長(zhǎng)度為194bp。
　　(2)利用超聲波法提取蘆筍根、母莖、擬葉、花、果實(shí)及不同發(fā)育時(shí)期嫩莖中的總皂苷，并利用茴香醛-濃硫酸比色法測(cè)定其含量。結(jié)果表明，蘆筍不同器官中的皂苷含

6、量存在很大差異，其中擬葉中的皂苷含量最高為29.28 mg/g DW，母莖的含量最低僅為擬葉的1/3左右;處于相同生長(zhǎng)期的蘆筍嫩莖，無論在發(fā)育的什么時(shí)期，嫩莖中部的皂苷含量最低，上部的皂苷含量最高;同一部位不同發(fā)育時(shí)期蘆筍嫩莖中的皂苷含量比較發(fā)現(xiàn)，各個(gè)生長(zhǎng)期間的皂苷含量無顯著差異，這也說明隨生長(zhǎng)時(shí)間的增加，嫩莖中干物質(zhì)積累與皂苷積累可能呈一定的關(guān)系穩(wěn)定增加;而在不同發(fā)育時(shí)期的蘆筍嫩莖中，無論在發(fā)育的什么時(shí)期，嫩莖中部的皂苷含量最低，而上

7、部和下部的皂苷含量差異較小。
　　(3)利用qRT-PCR技術(shù)分析了蘆筍皂苷合成關(guān)鍵酶基因在蘆筍根、母莖、擬葉、花、果實(shí)及嫩莖不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果表明，F(xiàn)PPS、SQS、SE、CAS基因在蘆筍不同器官及嫩莖不同發(fā)育時(shí)期的的表達(dá)量均具有較大的差異。FPPS、SQS、SE、CAS四個(gè)基因在根中的表達(dá)都很低，F(xiàn)PPS在母莖及花器官中的表達(dá)量較高;SQS、SE在母莖中的表達(dá)量最高;CAS基因在蘆筍花中的表達(dá)量最高。在蘆筍嫩莖中，各

8、基因在4-5cm嫩莖中的表達(dá)量相較低，9-10 cm時(shí)表達(dá)量升高，以后表達(dá)量基本穩(wěn)定;通過對(duì)蘆筍皂苷含量與各相關(guān)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，蘆筍皂苷合成與基因表達(dá)之間存在一定的相關(guān)性，初步建立了蘆筍皂苷合成酶基因的表達(dá)水平與皂苷在蘆筍植株中的積累的關(guān)系。
　　(4)基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)蘆筍雌雄株進(jìn)行miRNA測(cè)序，共得到153條已知的miRNA和39條蘆筍中新發(fā)現(xiàn)的miRNA，這些miRNA在植物的多種生物學(xué)進(jìn)程中具有重要的調(diào)控作用，如m

9、iR172a調(diào)控細(xì)胞分化及種子發(fā)育，miR171家族調(diào)控細(xì)胞分裂，miR167a調(diào)控花器官形成，miR166d調(diào)控植物體的防御系統(tǒng)等。在這些miRNA中有53條在蘆筍雌雄株中差異表達(dá)的miRNA。根據(jù)降解組測(cè)序結(jié)果，本研究中得到的miRNA中有35條miRNA找到了靶基因序列，其中還包括一些與生殖器官分化、花器官發(fā)育、性別分化相關(guān)的miRNA，如miR159、miR167、miR172等。通過基因本體論分析（Gene Othology，