紫花苜蓿皂苷合成途徑中重要相關(guān)基因的克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.）在世界范圍內(nèi)分布廣泛，是世界公認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草，莖葉中含有豐富的蛋白質(zhì)，被譽(yù)為“牧草之王”。苜蓿不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，其次生代謝產(chǎn)物苜蓿皂甙( alfalfa saponins）近年來(lái)被認(rèn)為是苜蓿的藥用功能的主要來(lái)源：具有良好的降膽固醇、血脂效果，還有抗炎、抗癌、抗菌、殺蟲(chóng)等藥用及生物活性。目前，對(duì)于苜蓿的開(kāi)發(fā)利用主要集中于提高家畜飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及改良飼料加工等方面，然而苜蓿皂甙等次生代謝產(chǎn)物卻極少

2、被研發(fā)成專(zhuān)門(mén)的產(chǎn)品或者添加劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。本文將對(duì)紫花苜蓿苜蓿皂甙合成途徑中關(guān)鍵酶基因進(jìn)行篩選、克隆和功能分析，為苜蓿品質(zhì)改良及選育新品種提供新的理論依據(jù)。取得的主要進(jìn)展如下：
　　1.通過(guò)同源克隆法擴(kuò)增首次獲得紫花苜蓿 SS cDNA序列，該基因含有一個(gè)1242 bp最大閱讀框，可編碼一個(gè)含413個(gè)氨基酸、分子量為47 kDa的蛋白。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，獲得的序列與截形苜蓿SS基因的同源性為97.91％，同時(shí)編碼的蛋白也高度相似，

3、相似度為93.53%，說(shuō)明該基因是紫花苜蓿SS基因，將其命名為MsSS。經(jīng)生物信息學(xué)分析，其編碼的蛋白有2個(gè)可能的跨膜螺旋區(qū)，其中C末端的疏水區(qū)域可能為膜結(jié)合區(qū)域；蛋白結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)保守區(qū)，其中3個(gè)高度保守。
　　2.利用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分析MsSS在紫花苜蓿不同組織和不同非生物脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，MsSS在根、莖、葉中均可表達(dá)，但存在著一定的組織性表達(dá)差異：其在根中表達(dá)量最高，其次是葉，莖中表達(dá)量最低。同時(shí)，MsSS

4、基因的表達(dá)受MeJA、ABA、GA3、紫外傷害及黑暗的誘導(dǎo)。紫花苜蓿各組織中 MsSS的表達(dá)量受 MeJa誘導(dǎo)后均有上升，同時(shí)苜蓿中各組織中總皂苷含量和鯊烯合酶含量及活性也均相應(yīng)的上升。初步證明， MsSS基因在紫花苜蓿皂苷生物合成中具有重要調(diào)控作用。
　　3.將含有全長(zhǎng)的MsSS cDNA和C端截短30個(gè)堿基的MsSS cDNA插入到原核表達(dá)載體pEASY-E2中，在轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后。結(jié)果顯示：全長(zhǎng)的M

5、sSS cDNA可在大腸桿菌中表達(dá)出分子量大小約為45 kDa蛋白，但均為包涵體蛋白；而含有C末端截短的MsSS cDNA的大腸桿菌中表達(dá)出分子量大小約為40 kDa的可溶性及包涵體蛋白。結(jié)合跨膜螺旋分析和結(jié)構(gòu)域分析得出：MsSS蛋白C末端的疏水區(qū)域?yàn)槟そY(jié)合區(qū)域。
　　4.構(gòu)建亞細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)載體 pA7-GFP-MsSS并轉(zhuǎn)入洋蔥表皮進(jìn)行亞細(xì)胞定位，通過(guò) GFP顯示綠色熒光信號(hào)間接確定MsSS基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。同時(shí)結(jié)合生物信

6、息學(xué)預(yù)測(cè)分析，只能初步判斷MsSS定位細(xì)胞質(zhì)上。
　　5.將植物超表達(dá)載體pBI121-MsSS通過(guò)農(nóng)桿菌(EHA105）介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到紫花苜蓿中，得到轉(zhuǎn)基因苗后對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行MsSS轉(zhuǎn)錄水平和總皂苷含量水平的檢測(cè)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中MsSS表達(dá)量和總皂苷量均高于野生型紫花苜蓿。
　　6.建立固相萃取(SPE）凈化后紫外分光光度法(UV）快速測(cè)定紫花苜蓿中總皂甙含量。最佳提取純化工藝：70%的乙醇溶液超聲輔助提取，離心取