紫花苜蓿鹽誘導(dǎo)基因的篩選與克隆.pdf

1、土壤鹽漬化是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素之一。植物抗鹽是一個(gè)由多基因控制的數(shù)量性狀，這決定了抗鹽機(jī)制的復(fù)雜性。雖然在植物耐鹽方面研究進(jìn)展迅速，但其具體分子生物學(xué)機(jī)制仍然不甚明了。本研究旨在通過分離和克隆與紫花苜蓿(Medicago sativa)鹽誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)基因，為揭示紫花苜?？果}分子機(jī)制、紫花苜蓿的耐鹽育種提供基礎(chǔ)。本研究取得的主要結(jié)果如下: 1、應(yīng)用SMRAT cDNA PCR技術(shù)擴(kuò)增了紫花苜蓿鹽脅迫和對(duì)照cDNA，產(chǎn)物

2、大部分彌散在0.7-2.0kb之間，并且有明顯的特征帶，這與大部分物種mRNA的真實(shí)大小與特征相符。擴(kuò)增后的cDNA進(jìn)行抑制性消減雜交，成功構(gòu)建了包含有810個(gè)克隆的紫花苜蓿鹽脅迫下生長與正常生長的差異表達(dá)cDNA文庫。隨機(jī)挑選12個(gè)克隆進(jìn)行PCR，結(jié)果表明插入片段主要分布在250～750bp之間，符合預(yù)期大小。 2、應(yīng)用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)從消減cDNA文庫中高通量篩選得到119個(gè)陽性差異表達(dá)克隆，測序后得到110

3、條有效的EST序列，總共82個(gè)單獨(dú)EST序列其中包含有16個(gè)contigs和66個(gè)singlets。將82個(gè)EST序列遞交至GeneBank，獲得相對(duì)應(yīng)的接受號(hào)從FE896855到FE896936。 3、EST序列的BLASTn結(jié)果顯示在82個(gè)EST中45個(gè)的同源基因?yàn)橐阎δ埽?7個(gè)為未知功能，其中有4個(gè)未找到同源序列。統(tǒng)計(jì)顯示肌醇-1-磷酸合成酶，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，水通道蛋白，肌醇半乳糖苷合成酶，冷

4、誘導(dǎo)特異蛋白，脫水蛋白頻率最高；BLASTp結(jié)果顯示，所獲得的EST可以分為物質(zhì)和能量代謝、轉(zhuǎn)錄、蛋白命運(yùn)、結(jié)合蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)體防御與自救、發(fā)育、轉(zhuǎn)運(yùn)、未分類、未知功能9類。 4、利用從文庫中篩選到的一個(gè)與大豆基因pGmPM10(accession No.AAA91965.1)同源的EST序列，進(jìn)行3′-RACE和5′-RACE，獲得一個(gè)cDNA全長序列為1728bp的基因，初步命名為MsLEA3-1(genebank ac

5、cession No.EU665182)。其最大開放閱讀框編碼一個(gè)含有436個(gè)氨基酸的蛋白，等電點(diǎn)為5.18，分子量為47.0KD。對(duì)MsLEA3-1蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析表明，與大豆LEA蛋白pGmPM10同源性最高，E值為1e-108。 5、蛋白質(zhì)氨基酸序列分析表明:①氨基酸組成及含量與其他LEA蛋白非常接近，小分子量氨基酸和親水性氨基酸含量非常高，致使蛋白質(zhì)高度親水，半胱氨酸和色氨酸含量很低；②氨基酸序列中存在31

6、個(gè)11-mer重復(fù)序列，其一致序列為TKDYAGDAAEK，表明MsLEA3-1為第3組LEA蛋白；③MsLEA3-1蛋白與大豆的pGmPM10和pGmPM8蛋白11-mer重復(fù)序列組成與分布非常接近，而與第3組LEA蛋白的聊Type Ⅰ和聊TypeⅡ 11-mer重復(fù)的氨基酸分布有所不同，推測MsLEA3-1蛋白pGmPM10和pGmPM8一樣屬于新的第三組LEA蛋白類型；④在MsLEA3-1蛋白的N端有明顯的信號(hào)肽特征，C端有-ER