胃癌相關(guān)miRNA的表達(dá)分析及功能研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　胃癌(Gastric cancer)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人類健康。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約20-24個(gè)核苷酸的小RNA，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)節(jié)著人類約三分之二的基因，miRNA在細(xì)胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用，越來越多引起研究人員的關(guān)注。隨著對(duì)于miRNA作用研究的進(jìn)一步深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA基因調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，包括胃癌等一系列

2、癌癥。在本論文中，針對(duì)胃癌高發(fā)區(qū)人群，首先通過胃癌組織與癌旁組織的芯片表達(dá)譜研究，篩選胃癌相關(guān)miRNA，并進(jìn)一步在高發(fā)區(qū)人群中應(yīng)用qRT-PCR對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行表達(dá)分析，同時(shí)展開臨床資料相關(guān)性分析，在此研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究胃癌相關(guān)miRNA對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。研究為明確miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及為胃癌的診斷和治療提供潛在生物標(biāo)志物。
　　研究方法與結(jié)果:
　　1.胃癌相關(guān)miRNA的篩選
　　本

3、研究收集胃癌高發(fā)區(qū)甘肅省武威市胃癌患者的癌組織及癌旁組織，患者均為經(jīng)病理診斷明確的胃癌新發(fā)病例，未經(jīng)放化療治療，共10對(duì)，同時(shí)收集患者臨床相關(guān)資料。使用Trizol裂解液提取組織總RNA，通過OD260/280值檢測(cè)來判斷RNA的純度，結(jié)果顯示，OD260/280值均在1.8-2.0之間，組織總RNA純度較好。采用高通量芯片對(duì)10對(duì)胃癌患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行miRNA/mRNA表達(dá)譜檢測(cè)，篩選出具有差異表達(dá)的61個(gè)miRNA，其中3

4、8個(gè)上調(diào)miRNA和23個(gè)下調(diào)miRNA。應(yīng)用DIANA-mirPath V.3軟件對(duì)miRNA和mRNA進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析，并構(gòu)建miRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分析胃癌差異化表達(dá)的miRNA的潛在功能。KEGG結(jié)果表明胃癌相關(guān)差異表達(dá)miRNA主要參與ErbB、PI3K-Akt、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等癌癥相關(guān)信號(hào)通路。
　　2.人群胃癌相關(guān)差異表達(dá)miRNA相關(guān)性分析
　　收集胃癌高發(fā)區(qū)患者癌組織及癌旁組織

5、共82對(duì)，通過qRT-PCR方法，對(duì)上述芯片結(jié)果中隨機(jī)挑選的3個(gè)具有差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，應(yīng)用配對(duì)T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示與癌旁組織相比，miR-9-5p在胃癌組織表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.05)，miR-3123和miR-133a-3p在胃癌組織表達(dá)明顯下調(diào)(p＜0.05)，與芯片結(jié)果一致。對(duì)miRNA分別在胃癌早期、中晚期表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示miR-9-5p和miR-3123在胃癌早期出現(xiàn)明顯表達(dá)水平的改變，miR-

6、133a-3p表達(dá)水平的差異在胃癌早期和中晚期呈現(xiàn)遞增，提示miR-9-5p和miR-3123可作為胃癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志，miR-133a-3p可作為胃癌進(jìn)展相關(guān)的潛在生物標(biāo)志。進(jìn)一步進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，對(duì)胃癌相關(guān)差異性表達(dá)miRNA和胃癌患者臨床資料進(jìn)行相關(guān)分析，包括性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、是否淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期等。結(jié)果顯示miR-133a-3p下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p＜0.05)。
　　3.胃癌相關(guān)差異表達(dá)

7、miRNA生物學(xué)功能研究
　　對(duì)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和不同胃癌細(xì)胞MKN-45、MGC-803進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與人正常胃粘膜上皮細(xì)胞相比，miR-9-5p在胃癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)，與芯片和人群研究結(jié)果一致。以GES-1為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行miR-9-5p mimics轉(zhuǎn)染，上調(diào)GES-1細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)水平，應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-9-5p表達(dá)改變對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、

8、細(xì)胞周期等細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。結(jié)果顯示，miR-9-5p上調(diào)后，GES-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期無顯著性改變(p＞0.05)，未發(fā)現(xiàn)單一miR-9-5p表達(dá)改變對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞生物學(xué)功能有影響。單個(gè)miRNA對(duì)細(xì)胞功能的影響可能較弱，今后需進(jìn)一步探討多個(gè)miRNA表達(dá)改變對(duì)細(xì)胞功能的影響。
　　研究結(jié)論:
　　本研究通過miRNA/mRNA芯片表達(dá)譜分析，在胃癌組織中篩選出61個(gè)差異表達(dá)miRNA。KEGG結(jié)果表明胃

9、癌相關(guān)差異表達(dá)miRNA主要參與ErbB、PI3K-Akt、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等癌癥相關(guān)信號(hào)通路。胃癌高發(fā)區(qū)人群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p在胃癌組織中高表達(dá)，miR-3123和miR-133a-5p在胃癌組織中低表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p和miR-3123在胃癌早期即出現(xiàn)明顯表達(dá)改變，提示其可作為胃癌早期診斷潛在生物標(biāo)志;miR-133a-3p表達(dá)改變?cè)谖赴┰缙诤椭型砥诔尸F(xiàn)遞增，且與淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示其可作為胃癌進(jìn)展相關(guān)