白介素-2基因轉(zhuǎn)染肝干細(xì)胞移植對肝癌大鼠模型治療作用的研究.pdf

1、第一部分人白介素-2基因轉(zhuǎn)染大鼠肝干細(xì)胞系建立及體外分化的基礎(chǔ)研究
　　 目的:建立能夠穩(wěn)定表達(dá)人白介素-2(hIL-2)的大鼠肝干細(xì)胞,并探討該轉(zhuǎn)染后的肝干細(xì)胞是否仍然具有自我更新以及向成熟肝細(xì)胞分化的能力。
　　 方法:(1)建立包裝有含hIL-2和EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒體系Plpcx-IL-2-EGFP,以之轉(zhuǎn)染肝干細(xì)胞WB-F344,并以嘌呤霉素篩選獲得抗性克隆,命名為WB-IL-2-EGFP。用RI-PCR、

2、Western blotting等方法檢測細(xì)胞內(nèi)hIL-2RNA轉(zhuǎn)錄和hIL-2蛋白表達(dá)的情況,從而證明WB-IL-2-EGFP細(xì)胞具有表達(dá)目的hIL-2蛋白的能力。(2)使用由肝細(xì)胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)等細(xì)胞因子和其他添加成分構(gòu)成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,體外誘導(dǎo)前面所建立的、WB-IL-2-EGFP細(xì)胞,觀察該細(xì)胞是否經(jīng)體外誘導(dǎo)后仍具有向成熟肝細(xì)胞分化的能力。分別觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)0天、3天、7天和15天的細(xì)胞生長情況,通過免疫

3、組化、免疫熒光、Western blotting等試驗方法檢測不同時間段的細(xì)胞中CK19、AFP和ALB蛋白的表達(dá)水平,從而分析WB-IL-2-EGFP細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后的生物學(xué)活性。
　　 結(jié)果:(1)經(jīng)轉(zhuǎn)染建立的WB-IL-2-EGFP細(xì)胞體外生長良好,經(jīng)多次傳代后熒光顯微鏡下仍可見穩(wěn)定表達(dá)EGFP蛋白的細(xì)胞生長；RT-PCR檢測hIL-2基因在WB-IL-2-EGFP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄情況,可見462bp左右目的條帶,證明有hIL-

4、2基因的轉(zhuǎn)錄；WB-IL-2-EGFP細(xì)胞Western blotting檢測可于17kD見特異條帶,證明有hIL-2的表達(dá)。(2)經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的WB-IL-2-EGFP細(xì)胞,免疫組化檢測顯示在不同時間段CK19表達(dá)逐步下降,AFP明顯下降,免疫組化檢測檢測顯示在不同時間段ALB表達(dá)上升,以誘導(dǎo)7天后明顯；同樣的趨勢也在Western blotting檢測結(jié)果中表現(xiàn)出來。
　　 結(jié)論:(1)WB-IL-2-EGFP細(xì)胞具有持續(xù)

5、增殖并具有穩(wěn)定地表達(dá)hIL-2蛋白以及EGFP蛋白的能力；(2)并在HGF、EGF等細(xì)胞因子和其他添加成分誘導(dǎo)下,有向成熟肝細(xì)胞方向分化的趨勢。
　　 第二部分人白介素-2基因轉(zhuǎn)染大鼠肝干細(xì)胞對肝癌治療作用的研究
　　 目的:研究WB-IL-2-EGFP細(xì)胞在受體大鼠肝臟內(nèi)生長增殖并表達(dá)目的基因的能力。研究WB-IL-2-EGFP細(xì)胞對肝癌治療以及腫瘤切除后復(fù)發(fā)的抑制作用。
　　 方法:(1)建立大量肝臟切除大鼠

6、模型,經(jīng)門靜脈注射WB-IL-2-EGFP細(xì)胞,一周后通過快速冰凍切片觀察該細(xì)胞在大鼠肝臟內(nèi)生長分布情況,RT-PCR、Westernblotting分別檢測hIL-2在大鼠肝臟內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),檢測大鼠血漿內(nèi)ALT、AST和ALB變化水平來觀察注射WB-IL-2-EGFP細(xì)胞對大鼠肝功能恢復(fù)的影響。(2)分別建立早期、晚期和肝癌切除術(shù)后的大鼠肝癌模型,經(jīng)門靜脈注射WB-IL-2-EGFP細(xì)胞進(jìn)入肝癌大鼠,一周后觀察早期肝癌、晚期

7、肝癌大鼠腫瘤大小變化以及肝癌切除術(shù)后大鼠的復(fù)發(fā)情況；采集大鼠肝臟,快速冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察WB-IL-2-EGFP細(xì)胞肝內(nèi)分布生長情況；采集肝癌大鼠血液,檢測ALT、AST和ALB等血液指標(biāo),來觀察大鼠肝功能變化；ELISA技術(shù)檢測大鼠血漿中IL-2的表達(dá)水平；流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同時間點(diǎn)內(nèi)大鼠血液中NK細(xì)胞水平的變化；另外建立長期帶瘤肝癌大鼠,觀察經(jīng)門靜脈注射WB-IL-2-EGFP細(xì)胞后,中位生存時間和生存曲線的變化情況。

8、>　　 結(jié)果:(1)經(jīng)肝臟切除大鼠模型門靜脈注射WB-IL-2-EGFP細(xì)胞后1周,取大鼠剩余肝臟組織,HE染色見肝干細(xì)胞移植后大鼠肝臟匯管區(qū)單個核細(xì)胞明顯較未注射大鼠增多,熒光顯微鏡下見WB-IL-2-EGFP細(xì)胞在肝內(nèi)散在分布,RT-PCR顯示出現(xiàn)462bp大小條帶,Western blotting檢測可于17kD見特異條帶,證明有WB-IL-2-EGFP細(xì)胞在大鼠肝臟組織內(nèi)能夠增殖生長,并穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白hIL-2。WB-IL-

9、2-EGFP細(xì)胞注射組和未注射組大鼠的血漿內(nèi)ALT、AST水平無明顯差別,而注射組大鼠血漿內(nèi)ALB水平較未注射組明顯高(p<0.05)。(2)熒光顯微鏡下見WB-IL-2-EGFP細(xì)胞于肝臟腫瘤組織周圍聚集,并穩(wěn)定表達(dá)目的基因。在早期肝癌大鼠模型和晚期大鼠肝癌模型中,WB-IL-2-EGFP細(xì)胞注射組腫瘤大小均小于未注射組,以早期組明顯(p<0.01),肝功能也較未注射組佳。而在肝癌切除大鼠中,而注射組肝功能佳,ALT、AST低于無注射

10、組(p<0.05),ALB高于無注射組(p<0.01)。在晚期腫瘤大鼠中,注射組血漿IL-2水平較未注射組明顯高(p<0.05)。早期肝癌大鼠中NK細(xì)胞比例無顯著差別,而在晚期腫瘤組中,注射組明顯較未注射組高(p<0.01)。肝癌切除大鼠中,注射組的NK細(xì)胞比例也較未注射組高(p<0.05)。注射WB-IL-2-EGFP細(xì)胞能夠延長肝癌大鼠生存時間,注射組中位生存時間明顯較未注射組長(27:45 d,P=0.038<0.05)。