腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染改良基因ND4進入線粒體.pdf

1、目的：探討攜帶改良ND4基因的腺相關(guān)病毒是否能增加細胞內(nèi)NADH脫氫酶亞基4（ND4）的表達并使其進入細胞線粒體內(nèi)。
　　方法：首先合成前后分別帶有COX10的線粒體定為序列和COX10的3‘非編碼區(qū)的核編碼ND4基因核苷酸序列，再構(gòu)建含有改良后ND4序列的重組腺相關(guān)病毒rAAV2/2-ND4，然后用構(gòu)建的rAAV2/2-ND4進行體內(nèi)和體外實驗進行驗證。體外試驗中，將培養(yǎng)的人293細胞分為三組，依次分別加入等量的PBS，AAV2

2、/2-GFP，AAV2/2-ND4，24小時后各組細胞分別進行免疫熒光、免疫印跡、實時定量PCR檢測ND4蛋白和mRNA的量。體內(nèi)實驗，SD大鼠被分為3組，分別依次進行玻璃體腔注射等量的PBS，AAV2/2-GFP，AAV2/2-ND4，注射后第30天取出各組小鼠視網(wǎng)膜分別進行免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡、實時定量PCR檢測ND4蛋白和mRNA的量。
　　結(jié)果：免疫熒光結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細胞線粒體內(nèi)ND4蛋白表達增加，玻璃體腔注射后小鼠視網(wǎng)膜

3、主要是節(jié)細胞層的細胞線粒體內(nèi)ND4蛋白增加。蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果證明了rAAV2/2-ND4使細胞內(nèi)甚至線粒體內(nèi)的ND4蛋白量相對于PBS組和AAV2/2-GFP組的增加是有統(tǒng)計學(xué)意義的。實時定量PCR的結(jié)果顯示rAAV2/2-ND4使細胞內(nèi)甚至線粒體內(nèi)的ND4 mRNA相對于PBS組AAV2/2-GFP組的增加是有統(tǒng)計學(xué)意義的
　　結(jié)論：構(gòu)建的rAAV2/2-ND4能夠使ND4蛋白在核編碼系統(tǒng)中表達出來并定向進入細胞線粒體內(nèi)，并進